口腔扁平苔蘚患者口腔黏膜超微結構特征和細胞凋亡檢測*

李相如，朱奎成，喬 彬

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔科 鄭州450052 2)鄭州大學實驗動物中心 鄭州450052

△女，1975年12月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:口腔黏膜病，E-mail:sywfirst@163．com

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種發(fā)生在口腔黏膜的慢性炎癥性疾病，為口腔黏膜癌前狀態(tài)，其組織病理學表現以上皮基底層角質形成細胞液化、變性、壞死以及固有層的T 淋巴細胞帶狀浸潤為主要特征。OLP 的發(fā)病機制尚不清楚［1］，目前很多學者［2-4］傾向于認為OLP 是一種自身免疫性疾病，病變主要源自細胞介導的免疫反應。OLP病損組織中淋巴細胞凋亡可能是持續(xù)的炎性細胞浸潤的一個主要原因［5］。細胞液化、變性可能與淋巴細胞浸潤所導致的角質形成細胞凋亡有關，并已證實膠樣小體即為凋亡小體［6］。該研究擬觀察OLP患者口腔黏膜超微結構特征以及病損區(qū)細胞凋亡的變化，為進一步探討OLP 的發(fā)病機制提供理論和實驗依據。

1 對象與方法

1．1 研究對象 2010年1月至2013年12月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院經組織病理學確診的OLP 初診患者35例(OLP組，含普通型10例，糜爛型25例)，男18例，女17例，年齡15～70歲，所有患者均為單純性口腔損害，無全身性疾病。選取沒有全身性疾病并且最近半年未接受任何治療的10 名健康人作為正常對照組。研究經鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審議批準，并獲得所有受試者的知情同意。

1．2 病理學觀察 取正常對照組口腔黏膜組織及OLP組病損區(qū)組織標本，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片后，行HE 染色，光鏡下觀察病理學表現。

1．3 超微結構的觀察 上述2種組織用戊二醛固定、脫水、滲透、包埋，制備厚度為50 nm 的超薄組織切片，透射電鏡下觀察組織超微結構。

1．4 細胞凋亡檢測 采取Dispase 冷酶消化法。PBS 漂洗上述2種組織塊，2．5 g/L Dispase 消化1～2 h。再用PBS 漂洗，顯微外科手術鑷分離上皮層及上皮下層。將上皮層加入到混合消化液［V(0．5 g/L 胰蛋白酶)∶V(0．2 g/L EDTA)=1∶1］中，37℃振蕩消化5～8 min，加小牛血清終止消化，吸管吹打成單細胞懸液，計數細胞。調整細胞密度為5 ×105mL－1，取1 mL 細胞懸液，1 000 r/min 離心10 min，棄上清液后，加入10 μL Annexin V-FITC(Intergen公司，美國)，反應30 min，加入300 μL Binding-Buffer 及5 μL PI，上流式細胞儀檢測。計算凋亡細胞百分率。

1．5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0 處理數據，采用兩獨立樣本的t 檢驗比較2組凋亡細胞百分率，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 病理學特征 正常對照組口腔黏膜組織病理學檢查未見異常(圖1A、B)。OLP組病損區(qū)口腔黏膜的組織病理學改變?yōu)?上皮過度角化或者角化不全，以棘層的增生最為多見;上皮形狀不規(guī)則，表現為鋸齒狀;基底層角質細胞排列紊亂，基底膜邊界不清，基底細胞液化、變性、壞死;固有層中可見密集的淋巴細胞浸潤帶，該浸潤帶主要分布在固有層的淺層，部分還可深入到固有層的深層或者黏膜下層。23例OLP 患者在上皮的基底層、棘層或黏膜固有層中可以見到圓形或者卵圓形、均質性及嗜酸性的膠狀小體，15例出現了上皮輕度不典型增生，細胞排列較亂、細胞層次增多、極性消失(圖1C、D)。

圖1 2組口腔黏膜組織病理學檢查結果(HE，×400)及OLP組超微結構的改變(×6 000)

2．2 超微結構 OLP組上皮棘層內角質細胞胞質內充滿排列紊亂的張力原纖維，內質網擴張，內含不定形物，線粒體腫大，峭消失，游離核糖體增多。多數細胞器減少，細胞核呈團塊狀且異染色質增多，核周間隙增寬，出現核旁空泡，細胞變形，橋粒結構破壞，細胞間隙明顯擴大。基底細胞與基底膜半橋粒及細胞間橋粒被破壞、分離，部分細胞變形、排列紊亂、錯位，水腫細胞間隙增寬，出現空泡、變性，胞質內線粒體腫脹，峭明顯減少(圖1E、F)。細胞核增大，異染色質增多，凋亡細胞增多。凋亡細胞主要表現為染色質沿核膜邊聚，且呈“C”形、新月形或團塊狀，并可見凋亡小體(圖1G、H)。正常對照組口腔黏膜超微結構未見異常。

2．3 細胞凋亡檢測結果 OLP組與正常對照組凋亡細胞百分率分別為(30．06 ±4．56)%和(7．70 ±0．69)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=15．392，P＜0．001)。

3 討論

為探討OLP 的發(fā)生與細胞凋亡之間的關系，該研究首先對35例OLP 患者進行病損區(qū)病理學觀察，結果顯示其組織病理學主要表現為:黏膜上皮表層的過度角化或者不全角化;部分上皮層出現輕度增生樣的改變，固有層出現淋巴細胞帶狀聚集;基底層角質細胞出現不同程度的液化、變性、壞死，基底層等可見嗜酸性膠狀小體，該膠狀小體有可能是由凋亡的角質形成細胞所形成。使用透射電鏡觀察OLP 病變組織的超微結構，發(fā)現OLP 病變組織的角質細胞核發(fā)生變性，棘層角質細胞的間隙明顯增寬，基底細胞線粒體腫脹，線粒體的內嵴消失，出現核旁空泡，角質細胞結構不完整，基底膜與基底層角質細胞分離，上皮細胞內出現凋亡小體，說明OLP 病變組織上皮內存在細胞凋亡。這與以往的研究［7-8］結果一致。以上這些形態(tài)學的變化表明OLP 患者體內存在細胞免疫反應，T 細胞有可能先是在病損的某個部位被激活，然后再到達口腔黏膜，并穿越已表達內皮細胞黏附分子的內皮細胞從而進入到結締組織，再進而攻擊基底層的角質形成細胞，最終產生病損。

檢測細胞凋亡的方法除了形態(tài)學觀察外，定量檢測常常使用TUNEL 法、流式細胞術、DNA 凝膠電泳等方法。目前國內外最常用的凋亡定量檢測方法是TUNEL 法，但該法最大缺點是壞死細胞亦呈現TUNEL 反應陽性［9］。該研究使用流式細胞術結合Annexin V 聯(lián)合PI 法，即對凋亡細胞雙染后用流式細胞儀檢測凋亡細胞。其優(yōu)勢在于:流式細胞術檢測早期細胞凋亡較TUNEL 法更為靈敏，而且Annexin V 聯(lián)合PI 染色不需固定細胞，可避免PI 染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL 法因固定出現的DNA 片段丟失。因此，Annexin V 聯(lián)合PI 法更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。

目前有關OLP 的發(fā)生與凋亡關系的研究結果不盡一致。Dekker 等［7］在研究中發(fā)現OLP組織中存在凋亡，周威等［10］卻發(fā)現OLP組凋亡細胞率低于正常組?？谇火つそM織上皮角質形成細胞的分離較為困難。該研究利用可以獲得單一角質形成細胞的冷酶消化法［11］分離OLP組織及正常口腔黏膜組織中的上皮角質形成細胞，采用流式細胞術檢測上述組織的細胞凋亡。結果顯示:OLP組凋亡細胞百分率高于正常對照組。提示OLP 的發(fā)生可能與上皮細胞凋亡的異常有關，有可能是在細胞因子的作用下，淋巴細胞的凋亡受到抑制，進而更多的淋巴細胞發(fā)揮更大的淋巴細胞毒作用，從而對組織造成損傷。

綜上所述，該研究初步證實了細胞凋亡異常在OLP 發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。然而，細胞凋亡在OLP 的發(fā)生中可能只是眾多步驟中的一環(huán)，其具體機制仍需進一步研究。

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