基于3種基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合端粒長(zhǎng)度構(gòu)建肺癌診斷支持向量機(jī)模型*

王 威，馮曉蕾，段曉冉，王團(tuán)偉，譚善娟，吳逸明，吳擁軍

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與衛(wèi)生毒理學(xué)教研室鄭州450001

肺癌發(fā)病率和病死率均居于全世界癌癥譜的首位，早期無(wú)特異癥狀。已有研究［1-2］發(fā)現(xiàn)，脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine traid，F(xiàn)HIT)、RASSF1A 和p16 等基因甲基化引起的抑癌基因表達(dá)沉默，以及外周血的DNA 端粒長(zhǎng)度縮短，會(huì)使肺癌的危險(xiǎn)性增加。課題組［3-4］前期進(jìn)行了一些研究，發(fā)現(xiàn)FHIT、p16、RASSF1 和外周血的DNA 端粒長(zhǎng)度4 項(xiàng)生物標(biāo)志在肺癌診斷中具備價(jià)值，構(gòu)建了肺癌診斷的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和決策樹(shù)模型，為進(jìn)一步研究肺癌早期診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。支持向量機(jī)是建立在結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小化原理和VC 維理論基礎(chǔ)上的一種數(shù)據(jù)挖掘方法，理論基礎(chǔ)堅(jiān)實(shí)，數(shù)學(xué)模型簡(jiǎn)明，克服了“維數(shù)災(zāi)難”，在解答小樣本、非線性和高維模式識(shí)別類(lèi)型這些問(wèn)題時(shí)獨(dú)具優(yōu)勢(shì)［5］。作者嘗試進(jìn)行基于以上4種生物標(biāo)志的肺癌診斷支持向量機(jī)模型的構(gòu)建。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 選擇2009年1月至2010年6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科和呼吸內(nèi)科確診為原發(fā)性肺癌的患者200例，其中腺癌72例，鱗狀細(xì)胞癌87例，大細(xì)胞肺癌8例，小細(xì)胞肺癌33例;同期沒(méi)有惡性腫瘤的健康體檢者200例作對(duì)照。經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，由醫(yī)生和專(zhuān)業(yè)調(diào)查員來(lái)收集血樣本以及包括年齡、性別、吸煙等在內(nèi)的流行病學(xué)資料。每天吸煙1 支且吸煙1 a 以上定義為吸煙［6］。

1．2 主要試劑和儀器 全血基因組DNA 提取試劑盒(上海萊楓公司)，PTC200 型PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ Research 公司)，Real-time PCR 儀(美國(guó)Startagene 公司)，引物(上海生工生物工程服務(wù)有限公司)，EPS-350 電泳儀(瑞典Pharmaera-LKB 公司)，GoTaq qPCR Mastermix(美國(guó)Promega 公司)，組織DNA 提取試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法 按照全血基因組DNA 提取試劑盒的要求進(jìn)行外周血基因組DNA 的提取;甲基化水平檢測(cè)的方法為實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR 法;甲基化水平(率)的計(jì)算參考文獻(xiàn)［7］;端粒長(zhǎng)度的測(cè)定采取實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法［8］。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 12．0 分析，定性資料兩樣本比較用χ2檢驗(yàn)。定量資料若符合正態(tài)分布，用ˉx±s 描述，若不符合，采取M(P25～P75)描述;兩樣本比較用秩和檢驗(yàn)或t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

1．5 數(shù)據(jù)挖掘

1．5．1 數(shù)據(jù)的預(yù)處理 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換:使用SPSS Clementine 12．0 對(duì)不符合正態(tài)分布的3個(gè)基因的甲基化水平做變量變換。數(shù)據(jù)分組:使用軟件SPSS Clementine 12．0 將數(shù)據(jù)隨機(jī)分成預(yù)測(cè)集和訓(xùn)練集2組，按3∶1 抽樣，將400個(gè)樣本分為訓(xùn)練集(對(duì)照者150個(gè)，肺癌患者150個(gè))和預(yù)測(cè)集(對(duì)照者50個(gè)，肺癌患者50個(gè))。

1．5．2 模型的建立 Fisher 判別分析模型:見(jiàn)文獻(xiàn)［2］。支持向量機(jī)模型:該模型在SPSS Clementine 12．0 中實(shí)現(xiàn)，輸入項(xiàng)設(shè)定為訓(xùn)練集的吸煙史、年齡、端粒長(zhǎng)度和FHIT、RASSF1A 及p16 基因甲基化水平，輸出項(xiàng)設(shè)定為group(肺癌=1，對(duì)照=2)?；诖搜芯糠蔷€性的訓(xùn)練樣本，采用非線性支持向量機(jī)算法，通過(guò)初步的探索后:Mode 為Expert，Kernel type 為Polynomial，Stopping criteria 為1．0E-3，Gamma 為1 被確定為最終的參數(shù)。

1．5．3 模型的評(píng)價(jià) 采用特異度、靈敏度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及ROC 曲線下面積(AUC)等指標(biāo)來(lái)進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，其中設(shè)定當(dāng)AUC＜0．5，無(wú)診斷意義;AUC 0．5～，準(zhǔn)確度極低;AUC 0．7～，準(zhǔn)確度比較好;AUC ＞0．9，準(zhǔn)確度最好。

2 結(jié)果

2．1 研究對(duì)象基本情況 肺癌組患者200 名，其中男143 名，女57 名;吸煙者107 名，不吸煙者93 名;年齡(59．6 ±10．6)歲;對(duì)照組200 名，其中男151名，女49 名;吸煙者79 名，不吸煙者121 名;年齡(53．7 ±13．3)歲;兩組間性別均衡，年齡和吸煙人數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/χ2 =9．537 和6．221，P =0．001 和0．005)。

2．2 肺癌組和對(duì)照組FHIT、RASSF1A 和p16 基因啟動(dòng)子甲基化水平及端粒長(zhǎng)度的比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

2．3 數(shù)據(jù)挖掘模型結(jié)果 對(duì)不符合正態(tài)分布的p16、RASSF1A 和FHIT 基因啟動(dòng)子的甲基化水平進(jìn)行正態(tài)性變換，其中p16 和FHIT 基因啟動(dòng)子的甲基化水平用取log10 變換，RASSF1A 基因啟動(dòng)子的甲基化水平用取平方根變換。最終得到的數(shù)據(jù)挖掘模型見(jiàn)表2。

2．4 模型的評(píng)估 見(jiàn)表3。

表3 兩數(shù)據(jù)挖掘模型的效果評(píng)估

3 討論

大量研究［9-10］結(jié)果表明，肺癌與FHIT、RASSF1A 和p16 基因的甲基化之間有關(guān)聯(lián)。該研究結(jié)果顯示，肺癌組和對(duì)照組FHIT、RASSF1A 和p16 基因啟動(dòng)子甲基化水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。端粒長(zhǎng)度變化將對(duì)端粒結(jié)構(gòu)和功能改變產(chǎn)生重要影響［11］。該研究發(fā)現(xiàn)肺癌組端粒長(zhǎng)度要短于對(duì)照組，提示端粒縮短是肺癌的危險(xiǎn)因素，這與文獻(xiàn)［12-13］研究結(jié)果相一致。

支持向量機(jī)具有完善的數(shù)學(xué)表達(dá)、出色的泛化功能、直觀的幾何圖形，在數(shù)據(jù)挖掘方面可以避免局部最優(yōu)解，完美解決過(guò)學(xué)習(xí)問(wèn)題。同時(shí)，它以結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小化為基本原理，強(qiáng)調(diào)置信區(qū)間的最小化，能夠很好地解決算法中復(fù)雜程度與泛化能力間的矛盾。支持向量機(jī)模型只和樣本數(shù)量有關(guān)，且人為設(shè)定的參數(shù)較少，便于使用，因此該模型在解決小樣本的問(wèn)題時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［14-15］。鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，支持向量機(jī)模型在臨床輔助診斷等方面也具有很大的潛力［16］。目前，卓越的分類(lèi)性能使支持向量機(jī)在多種數(shù)據(jù)挖掘方法中很受關(guān)注，在生物信息處理，特別是生物輔助診斷方面已取得了一系列很好的成績(jī)［17］。

該研究采用支持向量機(jī)模型對(duì)預(yù)測(cè)集的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)到81．0%，而判別分析模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度為67．0%，因此支持向量機(jī)模型在肺癌的輔助診斷方面可能具有較高的價(jià)值。課題組前期做了肺癌預(yù)測(cè)的相關(guān)工作，嘗試采取其他腫瘤標(biāo)志聯(lián)合數(shù)據(jù)挖掘建立數(shù)據(jù)挖掘模型，準(zhǔn)確度高達(dá)90%［18］。該研究建立的支持向量機(jī)模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度未達(dá)到該水平，考慮原因?yàn)?樣本發(fā)生了變化，篩選出的生物標(biāo)志物發(fā)生了變化。因此，需要綜合分析和比較研究樣本中的不同生物標(biāo)志，進(jìn)一步篩選出理想的生物標(biāo)志物，完善數(shù)據(jù)挖掘模型。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)人外周血DNA 端粒長(zhǎng)度和FHIT、RASSF1A、p16 基因啟動(dòng)子甲基化與肺癌有關(guān)，并首次成功構(gòu)建了基于上述4種生物標(biāo)志的肺癌診斷支持向量機(jī)模型，結(jié)果表明支持向量機(jī)在肺癌診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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