單細胞海藻提取物對人臍帶間充質(zhì)干細胞的抗衰老作用*

姚 寧，馬珊珊，崔淵博，渠瑞娜，王欣欣，孟 楠，宋及時，趙 云，高 軍，關方霞1，#

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州450001 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院干細胞研究室 鄭州450052 3)北京高新源新興技術開發(fā)有限公司北京100029

間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體［1］，在細胞治療、組織修復、基因治療等方面顯示出巨大的應用潛力［2-3］。但是在體外培養(yǎng)過程中，隨著傳代次數(shù)的遞增，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)的增殖和黏附力下降，細胞凋亡率增加，生物活性逐漸下降［4］。單細胞海藻(marine phytoplankton，MPPT)是海洋中重要的生物資源［5］，具有抗病毒、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤等生物學活性［6］。該實驗通過觀察MPPT 提取物對hUC-MSCs 增殖、凋亡以及衰老相關基因表達的影響，探討MPPT 對hUC-MSCs 的抗衰老作用及其可能機制。

1 材料與方法

1．1 標本和試劑 人臍帶標本來源于鄭州大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科正常剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦志愿捐獻的3 份臍帶，乙肝五項、HIV、HCV、梅毒等檢測均呈陰性。Trizol、qRT-PCR 試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa 公司，Western blot 相關試劑盒抗體均購自北京鼎國生物技術有限公司。熒光定量PCR 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。MPPT 提取物由北京高新源新興技術開發(fā)有限公司提供。

1．2 不同質(zhì)量濃度MPPT 提取物培養(yǎng)基的配制按10 g/L 的質(zhì)量濃度將MPPT 溶于DMEM/F12 培養(yǎng)基中，超聲破碎5 min，使用0．2 μm 過濾器無菌過濾培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中放置24 h，然后4℃保存，作為貯存液。使用時，用培養(yǎng)基將貯存液稀釋至所需質(zhì)量濃度(1、2、3、4、5 g/L)。

1．3 hUC-MSCs 的分離和傳代 取4 cm 長無菌臍帶組織，PBS 洗除余血，剪成約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，將組織塊移入培養(yǎng)瓶中，加入含體積分數(shù)10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基，置37℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞達90%融合時用2．5 g/L 胰蛋白酶消化，并按同一細胞密度傳代。

1．4 hUC-MSCs 免疫表型鑒定 取原代hUCMSCs(P0 細胞)、第3、10、15 代hUC-MSCs(P3、P10和P15 細胞)，采用流式細胞術檢測不同傳代次數(shù)的hUC-MSCs 表面CD44、CD29、CD90、CD31、CD45的表達情況。

1．5 qRT-PCR 檢測hUC-MSCs p16、p21、p53、PCNA、Sirt2 mRNA 的表達 分別收集P3、P10 和P15 細胞，采用Trizol 法抽提各代細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR 試劑盒并按照說明書進行操作，以GAPDH 作為內(nèi)參。引物序列見表1。反應條件:95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)。mRNA 相對表達量的計算采用文獻［7］方法。實驗重復3次。

表1 人p16、p21、p53、PCNA、Sirt2 及內(nèi)參引物序列

1．6 CCK-8 法檢測MPPT 提取物對hUC-MSCs增殖的影響 取第15 代hUC-MSCs，調(diào)整細胞密度為2 ×107mL－1。將細胞接種于96 孔板，每孔100 μL。實驗組分別加入100 μL 1、2、3、4、5 g/L MPPT提取物的培養(yǎng)液，對照組為正常培養(yǎng)的hUC-MSCs，每組3個復孔。在37℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別于1、2、3 和4 d 后避光下每孔加10 μL CCK-8 溶液并放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，然后使用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并繪制生長曲線。

1．7 PI 染色法檢測MPPT 提取物對hUC-MSCs細胞周期的影響 實驗分為3組，分別為P3組、P15組和1 g/L 的MPPT 提取物預處理的P15組(MPPT+P15組)，培養(yǎng)72 h 后終止培養(yǎng)，調(diào)整細胞密度為2 ×106mL－1。取1 mL 單細胞懸液，離心后去除上清，加入11 mL 預冷的PBS 重懸細胞，離心去除上清，加入1 mL 預冷的體積分數(shù)70%乙醇固定過夜。預冷PBS 洗去固定液，加入0．5 mL PI 染色液，37℃避光溫浴30 min，然后上流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1．8 FITC-Annexin V 染色法檢測MPPT 提取物對hUC-MSCs 凋亡的影響 細胞分組及處理同1．7。使用預冷PBS 洗去培養(yǎng)基，加入100 μL Binding Buffer 重懸細胞，加入5 μL FITC-Annexin V 和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，補加400 μL Binding Buffer，然后上流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1．9 qRT-PCR 檢測MPPT 提取物對hUC-MSCs p16、p21、p53、PCNA、Sirt2 mRNA 表達的影響 細胞分組及處理同1．7。qRT-PCR 檢測方法同1．3。

1．10 β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老情況 細胞分組及處理同1．5。吸取各組細胞培養(yǎng)液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min;去除細胞固定液，PBS 洗滌細胞3次，每次3 min;然后每孔加入1 mL 染色工作液，37℃孵育過夜。光學顯微鏡下觀察，藍染細胞為衰老細胞。100 倍鏡下選取3個視野，觀察并計算衰老細胞率。

1．11 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0 進行數(shù)據(jù)分析。不同組間細胞周期、細胞凋亡率、衰老細胞率及p16、p21、p53、PCNA、Sirt2 mRNA 相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 hUC-MSCs 的形態(tài)及生長特性 hUC-MSCs接種2 周后貼壁，10 d 后細胞形態(tài)呈長梭形(圖1A)。第3 代細胞形態(tài)呈長梭形(圖1B)，大小均一，平行排列。繼續(xù)培養(yǎng)至第10 代，細胞形態(tài)無明顯變化(圖1C)。當培養(yǎng)至第15 代時，細胞生長速度緩慢，細胞變大，形態(tài)雜亂(圖1D)。

圖1 不同傳代次數(shù)hUC-MSCs 的形態(tài)(×100)

2．2 hUC-MSCs 的免疫表型鑒定 不同傳代次數(shù)的hUC-MSCs 均表達CD29、CD44 和CD90，而不表達CD31 和CD45。

2．3 P3、P10、P15 細胞中p16、p21、p53、PCNA、Sirt2 mRNA 的表達 隨著傳代次數(shù)的增加，hUCMSCs 中p16、p21、p53 mRNA 的相對表達量逐漸增加，PCNA 和Sirt2 mRNA 的相對表達量逐漸減少。見表2。

表2 P3、P10、P15 細胞中p16、p21、p53、PCNA、Sirt2 mRNA 的相對表達量

2．4 不同質(zhì)量濃度MPPT 提取物對hUC-MSCs增殖的影響 低質(zhì)量濃度(1、2 g/L)MPPT 提取物可以促進hUC-MSCs 的增殖，而高質(zhì)量濃度(3、4、5 g/L)MPPT 提取物抑制細胞增殖(圖2)。故后續(xù)實驗采用1 g/L MPPT 提取物對hUC-MSCs 進行處理。

圖2 MPPT 提取物對hUC-MSCs 增殖的影響

2．5 MPPT 提取物對hUC-MSCs 細胞周期和凋亡的影響 結(jié)果見表3、4?？梢? g/L MPPT 提取物能夠促使細胞周期進入S 期，并可抑制細胞凋亡。

2．6 qRT-PCR 檢測MPPT 提取物對hUC-MSCs p16、p21、p53、PCNA、Sirt2 mRNA 表達的影響 結(jié)果見表5。

2．7 各組細胞衰老情況比較 結(jié)果見表6。

表3 各組細胞周期的變化 %

表4 各組細胞凋亡率的變化 %

3 討論

hUC-MSCs 是多能干細胞，易獲取和擴增，并且不涉及倫理問題［6］。但是由于體外分離培養(yǎng)原代細胞受外界因素的限制，長期培養(yǎng)的MSCs 生物學特性和遺傳穩(wěn)定性發(fā)生變化［8］。作者發(fā)現(xiàn)將hUCMSCs 連續(xù)傳代培養(yǎng)，P15 代hUC-MSCs 細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞增殖能力下降，衰老細胞增多。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，hUC-MSCs 中PCNA、Sirt2 mRNA 的相對表達量隨培養(yǎng)傳代次數(shù)增加而減少，而p16、p21、p53 mRNA 的相對表達量隨傳代次數(shù)增加而增加。該結(jié)果說明長期傳代培養(yǎng)的hUCMSCs 會發(fā)生復制性衰老，這與Beerman 等［8］的研究一致。

前期研究［9］發(fā)現(xiàn)，MPPT 能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖，并促進其分化。該研究發(fā)現(xiàn)1 g/L MPPT 提取物能夠促進hUC-MSCs 增殖，并抑制hUC-MSCs 凋亡。研究［10-13］發(fā)現(xiàn)，細胞的衰老是受一系列基因調(diào)控的，許多基因都參與這一復雜的生物過程，如p16、p21、p53、PCNA 和Sirt2 等。該研究發(fā)現(xiàn)，1 g/L 的MPPT 提取物能將hUC-MSCs 阻滯在S 期，降低p16、p21、p53 mRNA 的表達，提高PCNA和Sirt2 mRNA 的表達，降低衰老細胞率，從而增強hUC-MSCs 的增殖能力，發(fā)揮抗衰老作用。

綜上，該研究通過體外實驗初步探討MPPT 對hUC-MSCs 的抗衰老作用及其機制，下一步將繼續(xù)通過體內(nèi)實驗研究MPPT 對干細胞的抗衰老作用。

［1］Can A，Balci D．Isolation，culture，and characterization of human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells［J］．Methods Mol Biol，2011，698:51

［2］Dantuma E，Merchant S，Sugaya K．Stem cells for the treatment of neurodegenerative diseases［J］．Stem Cell Res Ther，2010，1(5):37

［3］程梅，王洪巖，于大海，等．臍帶間充質(zhì)干細胞長期體外培養(yǎng)的生物學特性及遺傳穩(wěn)定性［J］．中國生物制品學雜志，2014，27(3):356

［4］Cheung RC，Wong JH，Pan WL，et al．Antifungal and antiviral products of marine organisms［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2014，98(8):3475

［5］Aslam MN，Kreider JM，Paruchuri T，et al．A mineral-rich extract from the red marine algae lithothamnion calcareum preserves bone structure and function in female mice on a Western-style diet［J］．Calcif Tissue Int，2010，86(4):313

［6］于程程，湯勇勇，盛宏霞，等．人臍帶來源間充質(zhì)干細胞移植急性阿爾茨海默病模型小鼠引發(fā)的免疫應答反應［J］．中國組織工程研究，2012，16(19):3476

［7］Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2+－ΔΔCTmethod［J］．Methods，2001，25(4):402

［8］Beerman I，Maloney WJ，Weissmann IL，et al．Stem cells and the aging hematopoietic system［J］．Curr Opin Immunol，2010，22(4):500

［9］段小兵，關方霞，鄧曉輝，等．海洋單細胞海藻體外對人腦膠質(zhì)瘤干細胞生物學活性的影響［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(23):4215

［10］Gu Z，Tan W，F(xiàn)eng G，et al．Wnt/β-catenin signaling mediates the senescence of bone marrow-mesenchymal stem cells from systemic lupus erythematosus patients through the p53/p21 pathway［J］．Mol Cell Biochem，2014，387(1/2):27

［11］Jackstadt R，Jung P，Hermeking H．AP4 directly downregulates p16 and p21 to suppress senescence and mediate transformation［J］．Cell Death Dis，2013，4:e775

［12］Krishnamurthy J，Ramsey MR，Ligon KL，et al．p16INK4a induces an age-dependent decline in islet regenerative potential［J］．Nature，2006，443(7110):453

［13］閆海龍，龔勇珍．氧化應激及p16 和p53/p21 與細胞衰老關系的研究進展［J］．醫(yī)學綜述，2011，17(5):682