Ets2 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)EC9706細(xì)胞增殖、侵襲、周期和凋亡的影響*

楊 露，張楠楠，張彥婷，李慶華，許 堯，朱相展，#，關(guān)方霞1，#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州450052

Ets 家族是最大的信號(hào)依賴轉(zhuǎn)錄因子家族，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及上皮-間充質(zhì)的相互作用，參與許多生理和病理過(guò)程［1］。Ets2 為Ets 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究［2-3］表明，Ets2 的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究［4］發(fā)現(xiàn)，Ets2 在不同腫瘤組織中的表達(dá)水平存在差異，如在肺癌組織中低表達(dá)，而在乳癌組織中高表達(dá)。食管鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱食管鱗癌)是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，預(yù)后差，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。目前，關(guān)于Ets2 對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的影響報(bào)道較少，僅有研究［5］顯示Ets2 在食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)。該實(shí)驗(yàn)觀察了Ets2 在多個(gè)食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并通過(guò)RNA 干擾技術(shù)沉默Ets2的表達(dá)，分析Ets2 下調(diào)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲能力以及細(xì)胞周期的影響，從而探討Ets2 在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 食管上皮細(xì)胞Het-1A 及食管鱗癌細(xì)胞系EC1、Eca109、EC9706 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物所細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美國(guó)HyClone 公司)，SYBR?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(大連寶生物工程有限公司)，Ets2 多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)，GAPDH、E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2 等多克隆抗體和細(xì)胞全蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen 公司)，CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(廣州銳博生物有限公司)，Cell Invasion Assay Kit EC550(美國(guó)Chemicon 公司)，PI/RNase Staining Buffer 和Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit Ⅰ(美國(guó)BD 生物科學(xué)公司)。

1．2 4種細(xì)胞中Ets2 蛋白表達(dá)的檢測(cè) Het-1A、EC1、Eca109、EC9706 細(xì)胞均使用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，應(yīng)用Western blot 法檢測(cè)Ets2 蛋白。提取細(xì)胞總蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜后用50 g/L 脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加入Ets2 多克隆抗體(稀釋度1∶500)，4℃過(guò)夜孵育，加入相應(yīng)二抗(稀釋度1∶1 000)，37℃孵育1 h，以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，用eECL 發(fā)光液曝光，膠片經(jīng)掃描儀掃描后進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．3 EC9706 細(xì)胞分組與處理 實(shí)驗(yàn)所用siRNA片段由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)、提供，共3 對(duì)干擾片段。預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的有效片段序列正義鏈:5'-GCAG CAACUUGAAUUUGCUTT-3'，反 義 鏈:5'-AGCAAA UUCAAGUUGCUGCTT-3'。將EC9706 細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(NC組)，空白對(duì)照組(CON組)，轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(lip2000組)和Ets2 siRNA組(siRNA組)。嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后將含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基棄去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)。

1．4 E-cadherin、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白檢測(cè) 細(xì)胞按1．3 分組處理后，采用Western blot 法檢測(cè)3種蛋白的表達(dá)，具體操作同1．2。一抗為E-cadherin 多克隆抗體(1∶1 000)，Caspase-3 多克隆抗體(1∶400)，Bcl-2多克隆抗體(1∶400)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．5 EC9706 細(xì)胞增殖的檢測(cè) ①EdU 熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖。細(xì)胞分組同1．3。向培養(yǎng)板中加入EdU 溶液，室溫孵育2 h，PBS 洗滌。40 g/L 多聚甲醛固定30 min，甘氨酸溶液孵育5 min，PBS 清洗，然后用含體積分?jǐn)?shù)為0．5% TritonX-100 的PBS 漂洗。加入Apollo?染色反應(yīng)液，室溫、避光孵育30 min，甲醇和PBS 分別清洗2次。最后加入Hoechst 33342 反應(yīng)液，室溫、避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察染色細(xì)胞。400 倍視野下選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU 染色細(xì)胞(增殖細(xì)胞)和Hoechst 33342 染色細(xì)胞(總細(xì)胞)，細(xì)胞增殖率=增殖細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②CCK-8 方法檢測(cè)細(xì)胞增殖。細(xì)胞分組同1．3，且每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染完成后，培養(yǎng)48 h，倒掉舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 溶液。然后將其置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處讀取各孔的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率= ［(對(duì)照孔A值－實(shí)驗(yàn)孔A 值)/(對(duì)照孔A 值－空白孔A 值)］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．6 EC9706 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell法。細(xì)胞分組同1．3。取300 μL 37℃預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基加入到Transwell 小室的上室中，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1．5 h，使ECM 膜水化;棄去培養(yǎng)基，將300 μL 細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為2 ×105mL－1)加入到上室，并將500 μL 含體積分?jǐn)?shù)10% FBS 的新鮮培養(yǎng)基加入到下室;在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，取出小室用棉球輕輕擦除上表面未遷移的細(xì)胞，向下室中加入500 μL 染色液染色20 min，然后用PBS 清洗3次，最后在顯微鏡下觀察，取9個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，計(jì)算平均值。

1．7 EC9706 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集同1．3 分組轉(zhuǎn)染后48 h 的細(xì)胞，用PBS 洗2次，預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的冰乙醇固定，4℃過(guò)夜。1 000 r/min 離心5 min，棄去乙醇，PBS 洗2次。用0．5 mL 的PI/RNase Staining Buffer 重懸細(xì)胞，室溫孵育15 min 后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．8 EC9706 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin VFITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。用不含EDTA 的胰蛋白酶消化同1．3 分組轉(zhuǎn)染后48 h 的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106mL－1，取1 mL 細(xì)胞懸液，PBS 洗2次;用Binding Buffer 重懸細(xì)胞，然后向細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC 和PI 各5 μL，輕輕混勻后，避光、室溫孵育15 min;向每個(gè)處理組中加入400 μL的Binding Buffer，在1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡率。同時(shí)每組細(xì)胞設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組:未染色細(xì)胞、Annexin V-FITC 單染細(xì)胞、PI 單染細(xì)胞、Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 處理數(shù)據(jù)。4種細(xì)胞中Ets2 蛋白表達(dá)，4組EC9706 細(xì)胞中E-cadherin、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖率，增殖抑制率，遷移細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞周期分布及早期凋亡率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 Het-1A、EC1、Eca109 和EC9706 細(xì)胞中Ets2蛋白的表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A 相比，食管鱗癌細(xì)胞EC1、Eca109 和EC9706 中Ets2 蛋白的表達(dá)均升高，其中EC9706 細(xì)胞中的表達(dá)量最高，因此選擇EC9706 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Het-1A、EC1、Eca109和EC9706 細(xì)胞中Ets2 蛋白的表達(dá)

表1 不同細(xì)胞中Ets2 蛋白的表達(dá)

2．2 4組EC9706 細(xì)胞增殖的比較 EdU 法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。圖2 中紅色熒光代表增殖細(xì)胞，藍(lán)色熒光代表總細(xì)胞。CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。上述2種方法的檢測(cè)結(jié)果表明siRNA組細(xì)胞增殖率降低，增殖抑制率升高。

2．3 4組EC9706 細(xì)胞侵襲能力的比較 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3、表2。結(jié)果顯示，siRNA組EC9706 細(xì)胞的侵襲能力降低。

表2 4組EC9706 細(xì)胞增殖、侵襲能力比較

2．4 4組EC9706 細(xì)胞周期的比較 見(jiàn)表3，由表3可知，Ets2 沉默的EC9706 細(xì)胞周期無(wú)明顯變化。

表3 4組EC9706 細(xì)胞的周期分布 %

圖2 EdU 法檢測(cè)4組EC9706 細(xì)胞增殖(×400)

圖3 4組EC9706 細(xì)胞的侵襲能力(×400)

2．5 4組EC9706 細(xì)胞凋亡及3種蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)表4，由表4 可知，siRNA組EC9706 細(xì)胞早期凋亡率升高。Western blot 檢測(cè)E-cadherin、Caspase-3和Bcl-2 蛋白表達(dá)變化的結(jié)果見(jiàn)圖4、5 和表5，結(jié)果顯示，與NC組相比，siRNA組中E-cadherin 和Caspase-3蛋白表達(dá)量增加，而B(niǎo)cl-2 蛋白表達(dá)量減少。

表4 4組EC9706 細(xì)胞早期凋亡率比較 %

圖4 4組EC9706 細(xì)胞E-cadherin 蛋白的表達(dá)

圖5 4組EC9706 細(xì)胞Caspase-3 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)

表5 4組EC9706 細(xì)胞中E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2 蛋白的表達(dá)

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子Ets2 廣泛存在于各種細(xì)胞和組織中，但是在不同的細(xì)胞中其功能具有較大的差異性。Ets2 通過(guò)蛋白之間的相互作用或者信號(hào)介導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、周期和凋亡等［6］。研究［7］表明，Ets2 還參與調(diào)節(jié)胚胎血管的生成。同時(shí)，Ets2為許多信號(hào)通路的下游分子，如PI3K/AKT、Ras/Raf/MAPK 以及Ca2+依賴的有絲分裂信號(hào)通路等［8］。目前，在許多腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了Ets2 的異常表達(dá)［9-10］，Ets2 表達(dá)失調(diào)或者與其他蛋白融合參與了許多腫瘤事件的發(fā)生。Foulds 等［11］發(fā)現(xiàn)Ets2對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的生長(zhǎng)起不同的作用。在Ras 介導(dǎo)癌性轉(zhuǎn)化的NIH3T3 細(xì)胞中，高表達(dá)Ets2能逆轉(zhuǎn)已發(fā)生癌性轉(zhuǎn)化的NIH3T3 細(xì)胞，使細(xì)胞趨于恢復(fù)正常的細(xì)胞形態(tài)。這與之前報(bào)道的Ets2 高表達(dá)能夠促進(jìn)NIH3T3 細(xì)胞成瘤相矛盾［12］。在肺癌中亦發(fā)現(xiàn)針對(duì)相同細(xì)胞系，Ets2 既有致癌基因活性又有抑癌基因活性［8］。

由于Ets2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存在爭(zhēng)議，該研究檢測(cè)了其在食管上皮細(xì)胞Het-1A 和食管鱗癌細(xì)胞EC1、Eca109、EC9706 中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持Ets2 在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的觀點(diǎn)，且Ets2 在EC9706 細(xì)胞中的表達(dá)量最高。為研究Ets2在食管鱗癌發(fā)展中的作用，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA 干擾技術(shù)下調(diào)EC9706 細(xì)胞中Ets2 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ets2 表達(dá)下調(diào)后，EC9706 細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力顯著下降，黏附因子E-cadherin 的表達(dá)升高;細(xì)胞早期凋亡比例增加，推測(cè)為Ets2 下調(diào)可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，激活Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡;但細(xì)胞周期無(wú)明顯變化。以上實(shí)驗(yàn)證明Ets2表達(dá)下調(diào)能有效抑制食管鱗癌的發(fā)展，為進(jìn)一步研究Ets2 在食管鱗癌中的生物學(xué)功能，解決其是抑癌基因或癌基因的爭(zhēng)議提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Shiota 等［13］發(fā)現(xiàn)，Ets2 能夠調(diào)節(jié)Prdx1 的表達(dá)，且與Prdx1 表達(dá)呈正相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)［14］證明，抑制Prdx1表達(dá)能夠阻斷mTOR/p70S6K 信號(hào)通路。由此，初步推斷轉(zhuǎn)錄因子Ets2 可能通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR/p70S6K信號(hào)途徑參與食管鱗癌的發(fā)展過(guò)程，Ets2 可能成為食管鱗癌診斷的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

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