全反式維甲酸聯(lián)合5-氟尿嘧啶對ECA109細胞增殖、遷移和VEGF表達的影響*

李珊珊，羅忠民，崔會娟，王珍珍，彭 湃，李 娜，路太英#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052 2)焦作市第二人民醫(yī)院腫瘤科 焦作454002

食管癌是發(fā)病率高、預(yù)后較差的實體瘤之一。食管癌患者在診斷時多數(shù)已屬于晚期，失去手術(shù)治療的機會［1］，目前主要采用化療聯(lián)合放療等綜合治療方式，而化療往往引起諸多毒副反應(yīng)導(dǎo)致治療效果欠佳。近年研究［2］表明，誘導(dǎo)分化治療已成為一種重要的腫瘤治療方法，其中全反式維甲酸(AT-RA)是目前誘導(dǎo)分化劑中最重要并已用于臨床的藥物。5-氟尿嘧啶(5-FU)是消化系統(tǒng)常用化療藥物，但是逐漸出現(xiàn)的耐藥卻限制了其臨床應(yīng)用，因此臨床上主張聯(lián)合用藥。有研究［3］顯示，ATRA 和5-FU聯(lián)合應(yīng)用對食管癌細胞有協(xié)同抑制生長和誘導(dǎo)凋亡作用，但具體機制尚不完全清楚。該研究通過體外實驗觀察ATRA 聯(lián)合5-FU 對食管腫瘤血管生成的影響，探討兩者抑制腫瘤細胞生長的可能機制，為提高食管癌的療效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要藥物和試劑 DMEM 培養(yǎng)基、DMSO 均購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，ATRA(用無水乙醇配制成1 000 μmol/L 的儲備液，4℃避光保存)、MTT 均購自Sigma 公司，5-FU 購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體、即用型SABC 免疫組化染色試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Trizol 由美國Invitrogen 公司生產(chǎn)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司，PCR試劑購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．2 細胞培養(yǎng)和實驗分組 Eca109 細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室贈送。Eca109 細胞單層貼壁生長于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。常規(guī)傳代的Eca109 細胞分為4組:ATRA組(ATRA 終濃度為5 μmol/L)、5-FU組(5-FU 終濃度為50 mg/L)、ATRA +5-FU組(ATRA 終濃度為5 μmol/L，5-FU 終濃度為50 mg/L)和對照組(僅含Eca109 細胞)。

1．3 MTT 法檢測各組細胞生長抑制率 取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞密度為3 ×104mL－1，接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μL，貼壁后按1．2 分組并進行處理。每組設(shè)5個平行孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入MTT 液(5 g/L)20 μL。繼續(xù)孵育4 h 后棄去孔內(nèi)上清液，每孔加100 μL DMSO，振蕩搖勻。選擇490 nm 波長，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值，計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率=(1 －實驗組A 值/對照組A值)×100%。

1．4 劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化后以5 ×105個/孔接種于6 孔板中，作用24 h 后，用無菌槍頭沿細胞中部劃一條直線，按1．2 進行分組和處理。每組設(shè)3個平行孔。分別在0、24 h 拍照，用圖像處理軟件測量劃痕寬度，計算遷移率，遷移率=(1 －實驗組劃痕寬度/對照劃痕寬度)×100%。

1．5 RT-PCR 法檢測各組細胞VEGF mRNA 表達情況 收集經(jīng)不同處理組作用48 h 后的細胞，提取細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。VEGF(產(chǎn)物大小350 bp)上游引物:5'-AGGGCAGAATCATCACGAAG-3';下游引物:5'-CCTTTCCCTTTCCTCGAACT-3';內(nèi)參GAPDH(產(chǎn)物大小504 bp)上游引物:5'-TGATTCCACCCATG GCAAATTCC-3';下游引物:5'-ACAGCCTTGG CAGCGCCAGTAGA-3'。將引物與逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在50 μL 體系中進行擴增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次;最后72℃延伸10 min。循環(huán)完成后取10 μL PCR 產(chǎn)物在10 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳后，采用凝膠成像儀進行掃描拍照，用Gel Analyzer 軟件進行灰度值分析，以VEGF 條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值之比作為VEGF mRNA 的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1．6 免疫細胞化學(xué)法(SABC 法)檢測各組細胞VEGF 蛋白表達情況 按1．2 分組制作細胞爬片，加藥后培養(yǎng)48 h 取出，40 g/L 多聚甲醛固定30 min，體積分?jǐn)?shù)0．2% Trixton-100 處理15 min，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2室溫處理10 min，用試劑盒中的血清封閉液在37℃封閉20 min，加入一抗(1∶300 稀釋，兔抗人)4℃過夜，將PBS 代替一抗作為陰性對照;二抗孵育20 min，SABC 37℃孵育20 min，PBS反復(fù)漂洗，DAB 顯色10 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染15 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。鏡下觀察，每組細胞選取3 張爬片，采用病理圖像分析軟件進行半定量分析，以灰度值作為VEGF 蛋白的相對表達量。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進行數(shù)據(jù)分析。不同組間細胞生長抑制率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗;不同組間遷移率、VEGF mRNA 及蛋白相對表達量的比較采用2 ×2析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組細胞生長抑制率的比較 結(jié)果見表1。

2．2 各組細胞遷移率的比較0h時各組細胞遷移率均為0．00%。見表2、圖1。

表1 各組細胞生長抑制率的比較(n=5) %

表2 各組細胞遷移率的比較(n=3) %

圖1 不同處理對Eca109 細胞遷移能力的影響(×200)

2．3 各組細胞VEGF mRNA 和蛋白表達情況VEGF 蛋白陽性表達:呈棕黃或棕褐色顆粒狀，主要分布于細胞質(zhì)，核膜亦可見表達。見圖2、表3 和圖3。

圖2 各組細胞VEGF mRNA 表達情況

表3 各組細胞VEGF mRNA 和蛋白表達情況(n=3)

圖3 各組細胞VEGF 蛋白表達情況(SABC，×400)

3 討論

5-FU 是臨床常用抗腫瘤藥物，但其毒副作用限制了其在臨床上的應(yīng)用［4］。誘導(dǎo)分化治療最初是由Pierce 等［5］提出。分化誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)腫瘤細胞分化，使腫瘤細胞轉(zhuǎn)化為正常細胞或?qū)е录毎蛲?，可以改善腫瘤患者的預(yù)后，為腫瘤的化學(xué)藥物治療提供一個新領(lǐng)域。ATRA 作為重要的誘導(dǎo)分化劑之一，臨床研究比較廣泛。近年來，諸多學(xué)者［6-10］發(fā)現(xiàn)其在抑制實體腫瘤細胞增殖、促進細胞分化和凋亡方面有重要作用，但具體機制尚不明確。VEGF 在多種實體瘤組織中均有表達，在食管癌組織中的表達率可達65%，細胞株中可達100%［11］。實驗［12-14］表明ATRA 具有抑制多種腫瘤細胞分泌VEGF 的作用。Zage 等［15］研究表明，ATRA 可抑制神經(jīng)母細胞的VEGF-R，降低血管通透性，抑制內(nèi)皮細胞分裂、增殖和遷移，從而抑制腫瘤細胞增殖。有研究［16］發(fā)現(xiàn)，5-FU 對HepG2 肝癌細胞中VEGF 的表達具有抑制作用。

該研究結(jié)果顯示，ATRA 和5-FU 聯(lián)合作用于Eca109 細胞后，細胞生長抑制率明顯高于各單藥作用組及對照組;RT-PCR 及免疫細胞化學(xué)法檢測結(jié)果也提示，ATRA、5-FU 單藥作用均能下調(diào)VEGF mRNA 和蛋白的表達，且兩者聯(lián)合應(yīng)用下調(diào)作用更為明顯。由此提示，ATRA、5-FU 均可抑制Eca109細胞的生長，并且可能與其下調(diào)VEGF mRNA 和蛋白表達有關(guān)?；趯嶒灲Y(jié)果可以看出，兩者聯(lián)合應(yīng)用可以通過下調(diào)VEGF 的表達抑制腫瘤血管生成從而抑制細胞生長，增強化療療效。因此，化療聯(lián)合誘導(dǎo)分化劑ATRA 為食管癌的防治帶來一定的希望，為ATRA 在臨床上的應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

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