葛根芩連湯對慢性牙周炎合并動脈粥樣硬化大鼠TNF-α水平的影響*

李文娟，彭 偉，王 丹，方 謙，周 雪

河北聯(lián)合大學口腔醫(yī)學院唐山063000

△女，1987年6月生，碩士研究生，醫(yī)師，研究方向:口腔內(nèi)科學，E-mail:562649611@qq．com

近年來慢性牙周炎和心血管疾病的關系備受關注。資料［1］表明，冠心病和外周動脈粥樣硬化的患者口腔衛(wèi)生不良率和牙周炎患病率均較高，牙周炎患者中冠心病的發(fā)病率明顯增加。慢性炎癥可增加心血管疾病患者動脈粥樣硬化的風險，炎癥在動脈粥樣硬化發(fā)生、斑塊發(fā)展、斑塊破裂過程中起著重要作用［2-5］，并在一定程度上決定著粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性和自然進程。對于牙周炎目前多采用手術治療、基礎治療配合藥物治療，但是心血管疾病患者對手術和基礎治療往往不耐受。中藥復方制劑因含多種成分，具有多方位的綜合效用，如抗菌譜廣、高效、低毒、廉價、取材廣泛等。作者采用中藥葛根芩連湯對慢性牙周炎合并動脈粥樣硬化的大鼠模型進行治療，并觀察其對牙周組織及血清TNF-α 水平的影響，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要材料 Wistar 大鼠，雄性，體重(200 ±20)g(北京華阜康生物科技股份有限公司);葛根芩連湯合劑:由葛根(批號1110035)、黃芩(批號1202152)、黃連(批號1111019)、炙甘草(批號1112083)中藥配方顆粒(葛根15 g、黃芩9 g、黃連9 g、炙甘草6 g，廣州一方制藥有限公司)組成，唐山市中醫(yī)醫(yī)院提供;甲硝唑片(亞寶藥業(yè)集團有限公司，批號111020)，阿托伐他汀片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號H20093819);大鼠TNF-α 多克隆抗體(博奧森科技有限公司)，PV-6001 二步法免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);酶標儀、Olympus 顯微鏡等。

1．2 動物分組及模型建立 40只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為2組:對照組(N組)10只、模型組(D組)30只。D組:將左上頜第二磨牙牙周結扎，高脂飲食輔助藥物誘導，持續(xù)12 周，建立慢性牙周炎合并動脈粥樣硬化模型［6］。N組:不進行上述處理。12 周末N組和D組均處死5只大鼠，HE 染色觀察牙周組織和腹主動脈病理變化，驗證造模結果。造模成功后將D組大鼠分成5組:鹽水治療組(D1組)、甲硝唑治療組(D2組)、阿托伐他汀治療組(D3組)、甲硝唑聯(lián)合阿托伐他汀治療組(D4組)、葛根芩連湯治療組(D5組)，每組5只大鼠。甲硝唑用量0．05 g/(kg·d)，阿托伐他汀用量0．08 g/(kg·d)，葛根芩連湯用量0．42 g/(kg·d)［7］;N組、D1組灌胃生理鹽水;所有動物灌胃體積不超過4 mL/(kg·d)，每天灌胃1次，灌胃4 周后，處死所有動物。

1．3 牙周組織和腹主動脈標本采集及HE 染色觀察 分別于實驗第12、16 周取動物上頜標本，經(jīng)生理鹽水清洗后，40 g/L 多聚甲醛溶液固定48 h 以上，在滴水條件下進行組織修整，放入100 g/L EDTA 脫鈣液(pH=7．3)4℃水浴脫鈣4 周，常規(guī)石蠟包埋，沿牙周組織塊頰舌向切片，片厚5 μm。取腹主動脈段置體積分數(shù)10%甲醛溶液中保存，石蠟包埋、切片。上述標本分別進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察。

1．4 免疫組化法觀察牙周組織和腹主動脈中TNFα 的表達 采用免疫組化PV 二步法觀察TNF-α 在牙周組織和腹主動脈中的表達，嚴格按照說明書步驟進行操作，應用Image-Pro Plus 6．0 計算機圖像分析系統(tǒng)半定量分析TNF-α 的表達水平。

1．5 血清TNF-α 水平檢測 分別于第12 和16 周末時，各組動物禁食12 h，采腹主動脈血5 mL，離心取上清，用ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-α 水平。嚴格按說明書進行操作。

1．6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0 進行數(shù)據(jù)分析，不同組間牙周組織和腹主動脈中TNF-α 的表達水平及血清中TNF-α 水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，檢驗水準α =0．05。

2 結果

2．1 牙周組織和腹主動脈HE 染色結果 見圖1。N組:牙齦上皮結構完整，結合上皮、溝內(nèi)上皮結構正常，牙周膜纖維排列整齊，牙槽嵴處未見骨吸收;血管管壁均勻一致，沒有內(nèi)層增生。D組:牙周炎癥破壞明顯，結合上皮與牙面分離，上皮向根方增殖，組織深部可見大量炎癥細胞浸潤，骨小梁稀疏，牙槽骨表面可見骨吸收，牙槽嵴頂高度降低，呈垂直吸收，牙周膜纖維粗細不均或斷裂，排列紊亂;腹主動脈內(nèi)層增厚，管腔明顯縮窄，出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊。D5組治療4 周后，牙周組織炎性細胞浸潤比D1組明顯減少，牙槽嵴吸收程度減輕，牙齦上皮炎癥有不同程度的減輕，牙周膜纖維排列較整齊;腹主動脈內(nèi)膜厚度變薄，增生不明顯。D2組、D3組、D4組牙周組織炎癥均減輕。

2．2 牙周組織和腹主動脈中TNF-α 的表達 結果見圖2、表1。

圖1 各組大鼠牙周組織(1)和腹主動脈(2)病理變化(HE，×200)

圖2 各組大鼠牙周組織(1)和腹主動脈(2)TNF-α 的表達(PV，×400)

表1 各組大鼠牙周組織和腹主動脈中TNF-α 的相對表達量

2．3 血清TNF-α 水平檢測結果 見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α 水平比較 ng/L

3 討論

葛根芩連湯最早出自漢代張仲景《傷寒論》，是具有祛邪、升清、生津之功效的經(jīng)典名方。葛根素被廣泛應用于心腦血管疾病的預防及治療［8］，研究［9］還發(fā)現(xiàn)其具有促進成骨細胞合成和分泌堿性磷酸酶的作用，同時可以造成體外培養(yǎng)的破骨細胞空泡性變、骨吸收陷窩面積減少等。配方中黃芩的有效成分具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基的作用，并對免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)有保護作用［10］。Tsao 等［11］研究證實，黃芩煎劑對多種牙周病病原菌有抑制作用;湯亞玲等［12］研究證實，黃芩水浸膏具有抑制牙髓卟啉單胞菌生長、降解LPS 的作用。另有研究［13］發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物能阻斷牙周炎癥過程，促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，并能明顯抑制LPS 引起的炎癥反應，促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成。配方中的黃連含有多種生物堿成分，其中的小檗堿具有預防頸動脈粥樣硬化的作用［14］。黃連素通過提高低密度脂蛋白受體的表達而實現(xiàn)降脂作用［15］，在臨床上黃連素治療高脂血癥已取得了確切的療效［16-17］。

在心血管系統(tǒng)疾病中，TNF-α 可以通過改變鈣離子平衡、氧化張力、破壞興奮-收縮偶聯(lián)等方式導致心肌功能障礙。在牙周病中，TNF-α 可以作為始動因子引發(fā)炎癥反應;誘導破骨細胞的產(chǎn)生，引發(fā)牙槽骨吸收;增加基質(zhì)金屬蛋白酶的生成，破壞膠原纖維;誘發(fā)基質(zhì)細胞凋亡，阻礙牙周組織的修復等等。由于TNF-α 在兩種疾病中發(fā)揮重要作用，因此以TNF-α 為靶點的治療十分有意義。中藥復方制劑因含多種成分，具有多方位的綜合效用。在此實驗中，作者選用了西藥阿托伐他汀、甲硝唑、甲硝唑聯(lián)合阿托伐他汀作為對照藥，結果顯示D5組炎癥因子水平低于各西藥單純用藥組，與聯(lián)合用藥組治療效果相似。但是長期使用廣譜抗生素和化學合成藥在清除致病菌的同時，也會破壞口腔的微生態(tài)平衡，導致多種毒副作用。故對于牙周炎合并動脈粥樣硬化的慢性炎癥性疾病的治療，選擇天然植物藥具有良好的應用前景。該實驗采用葛根芩連湯對實驗大鼠進行干預，結果顯示D5組、D2組、D3組以及D4組牙周組織和腹主動脈以及血清中TNF-α 水平均較D1組明顯降低。說明葛根芩連湯能降低牙周炎合并動脈粥樣硬化模型大鼠TNF-α 水平，對牙周炎合并動脈粥樣硬化大鼠有很好的治療效果，提示牙周炎與動脈硬化同時治療有利于改善機體的炎癥狀態(tài)及心血管功能。

［1］Simonka M，Skaleric U，Hojs D．Condition of teeth and periodontal tissue in patients who had suffered a heart attack［J］．Zobozdrav Vestn，1988，43(3/5):81

［2］Khader YS，Albashaireh ZS，Alomari MA．Periodontal diseases and the risk of coronary heart and cerebrovascular diseases:a meta-analysis［J］．J Periodontol，2004，75(8):1046

［3］Spahr A，Klein E，Khuseyinova N，et al．Periodontal infections and coronary heart disease:role of periodontal bacteria and importance of total pathogen burden in the Coronary Event and Periodontal Disease(CORODONT)study［J］．Arch Intern Med，2006，166(5):554

［4］鐘慧敏，常春榮，張建全，等．冠心病患者的牙周狀況與Fg 和hs-CRP 相關性的研究［J］．口腔醫(yī)學研究，2011，27(2):123

［5］Gotsman L，Lotan C，Soskolne WA，et al．Periodontal destruction is associated with coronary artery disease and periodontal infection with acute coronary syndrome［J］．J Periodontol，2007，78(5):849

［6］鐘良軍，徐雋，張源明，等．慢性牙周炎和動脈粥樣硬化動物模型的建立及研究［J］．中華口腔醫(yī)學雜志，2009，44(8):464

［7］徐叔云．藥理實驗方法學［M］．3 版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:203

［8］岳紅文，胡小琴．葛根及葛根素對心血管系統(tǒng)的藥用價值［J］．中國中西醫(yī)結合雜志，1996，16(6):382

［9］金為旭，苗波．局部注射葛根素對鼠拔牙后剩余牙槽嵴吸收影響的研究［J］．北京口腔醫(yī)學，2010，18(2):77

［10］Kowalczyk E，Krzesinski P，Kura M，et al．Pharmacological effects of flavonoids from Scutellaria baicalensis［J］．Przegl Lek，2006，63(2):95

［11］Tsao TF，Newman MG，Kwok YY，et al．Effect of Chinese and western antimicrobial agents on selected oral bacteria［J］．J Dent Res，1982，61(9):1103

［12］湯亞玲，譚紅，李繼遙，等．黃芩對產(chǎn)黑色素類桿菌內(nèi)毒素影響的實驗研究［J］．廣東牙病防治，2002，10(2):94

［13］Chung CP，Park JB，Bae KH．Pharmacological effects of methanolic extract from the root of Scutellaria baicalensis and its flavonoids on human gingival fibroblast［J］．Planta Med，1995，61(2):150

［14］何國厚，劉勇，艾志兵，等．小檗堿對兔頸動脈粥樣硬化形成的干預作用［J］．神經(jīng)損傷與功能重建，2006，1(1):42

［15］Kong W，Wei J，Abidi P，et al．Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins［J］．Nat Med，2004，10(12):1344

［16］勾祥輝，宗永學．黃連素治療高脂血癥59例［J］．人民軍醫(yī)，1995(2):35

［17］魏敬，蔣建東，吳錦丹，等．鹽酸小檗堿的調(diào)脂作用的研究［J］．中華糖尿病雜志，2005，13(1):49