格特隱球菌在河北地區(qū)引起1例腦膜炎的臨床與實(shí)驗(yàn)研究

竇紅濤 萬喆 楊啟文 王瑤 王賀 謝秀麗 劉娟 李若瑜 徐英春

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心，北京100034）

格特隱球菌在河北地區(qū)引起1例腦膜炎的臨床與實(shí)驗(yàn)研究

竇紅濤1萬喆2楊啟文1王瑤1王賀1謝秀麗1劉娟1李若瑜2徐英春1

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心，北京100034）

目的 報(bào)道1例我國河北地區(qū)由格特隱球菌引起的腦膜炎，并對該菌進(jìn)行試驗(yàn)研究。方法 將分離自患者腦脊液中的隱球菌分別接種于Chromagar顯色培養(yǎng)基和刀豆氨酸?甘氨酸?溴麝香草酚藍(lán)（CGB）培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)，使用API 20C AUX、全自動微生物鑒定儀Vitek 2 Compact、生物梅里?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析（MALDI?TOF MS）、rDNA ITS和IGS序列分析等方法對該菌進(jìn)行菌種鑒定，并使用ATB FUNGUS 3進(jìn)行抗真菌藥敏試驗(yàn)。結(jié)果 該菌在顯色培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)48 h后為白色略帶粉色菌落，在CGB培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)5 d后使CGB培養(yǎng)基由黃色變?yōu)樗{(lán)色。API 20C AUX、Vitek 2 Compact和MALDI?TOF MS的鑒定結(jié)果均為新生隱球菌，rDNA ITS和IGS序列分析均提示該菌為格特隱球菌。5?氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑?qū)υ摼淖钚∫志鷿舛确謩e是≤4 μg／mL、≤0.5 μg／mL、≤1 μg／mL、≤0.125 μg／mL、≤0.06 μg／mL。結(jié)論 CGB培養(yǎng)基、rDNA ITS和IGS序列分析能夠區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌，應(yīng)重視格特隱球菌的分離鑒定。

格特隱球菌；河北地區(qū)；CGB培養(yǎng)基；鑒定；序列測定；抗真菌藥敏試驗(yàn)

［Chin J Mycol，2015，10（1）：11?15］

隱球菌屬［1］有37多個種，但是其中僅有新生隱球菌和格特隱球菌與人類感染最為密切。新生隱球菌地域分布廣泛，可從鳥糞、鳥巢、樹干等處分離，又分為格魯比變種和新生變種，多感染免疫缺陷患者。格特隱球菌主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)，多感染免疫正常人群，1999年以來格特隱球菌在地處溫帶的加拿大溫哥華島及美國部分地區(qū)引起了人類隱球菌感染的爆發(fā)流行，然而關(guān)于我國格特隱球菌感染臨床特征的研究匱乏，格特隱球菌感染主要分布在上海、江蘇、福建、浙江、廣東、海南等省份［2］，華北地區(qū)尚未見報(bào)到。本文報(bào)道格特隱球菌引起隱球菌性腦膜炎一例，該患者來自華北地區(qū)，免疫力正常。本研究在使用Chromagar顯色培養(yǎng)基和刀豆氨酸?甘氨酸?溴麝香草酚藍(lán) （Canavanine?glycine?bromthymol blue，CGB）培養(yǎng)基、API 20C AUX、Vitek等常規(guī)鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用生物梅里埃的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析 （Matrix?Assisted Laser Desorption Ionization?Time?of?Flight Mass Spectrome?try，MALDI?TOF MS）以及核糖體DNA的 ITS和IGS序列分析鑒定該菌。

1 材料和方法

1.1 病歷摘要

患者，男，62歲，來自河北衡水，務(wù)農(nóng)，無出差史，無明顯誘因出現(xiàn)間斷頭痛、發(fā)熱44 d，最高體溫38.8℃，全身乏力，后發(fā)展為雙顳部跳痛乃至全腦部疼痛，伴惡心、非噴射性嘔吐兩次，頭顱CT未見明顯異常，胸部CT顯示雙肺結(jié)節(jié)影，HBsAg、HCV?Ab、HIV?Ab均為陰性，血常規(guī)基本正常，凝血正常，ESR、CRP、Ig正常，補(bǔ)體CH50 60.5 U／mL，T細(xì)胞亞群：CD4＋、CD8＋細(xì)胞比例正常，血清腫瘤標(biāo)記物正常，抗酸染色陰性，結(jié)核抗體陰性。腰穿腦脊液壓力為330 mmH2O，腦脊液生化提示蛋白含量1.91 g／L，糖0.9 mmol／L，氯化物111 mmol／L，細(xì)胞總數(shù)450／mm3，白細(xì)胞170／mm3，單核30%。腦脊液新生隱球菌抗原檢測陽性1∶1 024，腦脊液墨汁染色陽性，腦脊液培養(yǎng)陽性為新生隱球菌，診斷為隱球菌性腦膜炎，兩性霉素B從1 mg逐漸加量至25 mg Qd（1?3?5?10?15?25）聯(lián)合氟康唑200 mg Bid治療，后改為聯(lián)合5?FC 2 g Tid。出現(xiàn)意識模糊后，右側(cè)腦室穿刺引流，留置引流管，每周一、三、五行兩性霉素B鞘內(nèi)注射，劑量分別為0.1 mg?0.2 mg?0.2 mg?0.2 mg?0.4 mg。愈后較好，出院后，繼續(xù)口服氟康唑200 mg Qd鞏固治療1 a，至今未見復(fù)發(fā)。該患者沒有基礎(chǔ)疾病，屬于免疫正常人群，來自我國溫帶地區(qū)，腦脊液壓力較高，經(jīng)規(guī)范的抗隱球菌治療愈后較好。

1.2 試驗(yàn)菌株

除從上述患者腦脊液中分離到的菌株 （編號PU8）外，同時選取北京大學(xué)第一醫(yī)院真菌與真菌病研究中心惠贈的新生隱球菌（ATCC32045）和格特隱球菌（日本千葉大學(xué)真菌醫(yī)學(xué)研究中心），分別編號PU58、PU61。

1.3 常規(guī)鑒定

Chromagar顯色培養(yǎng)基鑒定 Chromagar顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽公司，接種試驗(yàn)菌株后35℃培養(yǎng)。

CGB培養(yǎng)基鑒定 CGB培養(yǎng)基按照參考文獻(xiàn)配制［3］，接種試驗(yàn)菌株后35℃培養(yǎng)。

API 20C AUX鑒定 按照API 20C AUX說明書操作。

Vitek鑒定 使用全自動微生物鑒定儀Vitek 2 Compact配套的YST酵母菌鑒定卡上機(jī)鑒定。

1.4 分子鑒定

MALDI?TOF MS鑒定 使用生物梅里埃的MALDI?TOF MS質(zhì)譜分析。

rDNA ITS和IGS序列分析 參照Meyer等［4］的方法提取基因組DNA。用真菌通用引物ITS1與ITS4擴(kuò)增其rDNA ITS區(qū)，用IGSF與IGSR引物擴(kuò)增其IGS區(qū)，引物ITS1、ITS4、IGSF和IGSR的序列分別為 ITS1，5‘?TCCGTAGGTGAACCT?GCGG?3’，ITS4，5‘?TCCTCCGCTTATTGATATGC?3’，IGSF，5?‘ATCCTTTGCAGACGACTTGA?3’，IG?SR，5‘?GTGATCAGTGCATTGCATGA?3’。ITS PCR反應(yīng)條件［5］：98℃變性30 s；然后98℃變性5 s，56℃退火5 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸1 min。IGS PCR反應(yīng)條件［5］：98℃變性30 s；然后98℃變性5 s，60℃退火5 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司雙向測序。原始序列與其序列彩圖對比、分析并拼接后進(jìn)入GenBank進(jìn)行同源序列搜索 （http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）。使用序列分析軟件CLC 6.8.1（http：／／www.clcbio.com／products／clc?sequence?viewer／）分別對PU8、PU58和PU61的ITS及IGS序列進(jìn)行比較。

1.5 抗真菌藥敏試驗(yàn)

使用生物梅里埃公司的ATB FUNGUS 3對PU8進(jìn)行抗真菌藥敏試驗(yàn)，測試該菌對5?氟胞嘧啶（5?FC）、兩性霉素B（AMB）、氟康唑（FLC）、伊曲康唑 （ITR）、伏立康唑 （VRC）的最小抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié) 果

2.1 Chromagar顯色培養(yǎng)基鑒定

在Chromagar顯色培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48 h后PU8、PU58及PU61均為白色略帶粉色菌落，PU8及PU58略顯干燥，而PU61為黏液型菌落見圖1。

2.2 CGB培養(yǎng)基鑒定

CGB培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)5 d后，接種 PU8和PU61的CGB培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色，而接種PU58的CGB培養(yǎng)基仍為黃色（見圖2）。

2.3 常規(guī)方法及分子方法鑒定

常規(guī)方法及分子方法的鑒定結(jié)果見表1。對于PU8和PU61，API 20C、Vitek及質(zhì)譜分析的鑒定結(jié)果均為新生隱球菌，但rDNA ITS序列和IGS序列分析的鑒定結(jié)果為格特隱球菌，PU58常規(guī)方法及分子方法的鑒定結(jié)果均為新生隱球菌。

2.4 rDNA ITS和IGS的序列比較

PU8、PU58和PU61的rDNA ITS序列比較見圖3，PU8、PU58和PU61的IGS序列比較見圖4。

2.5 藥敏結(jié)果

5?氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑?qū)υ摼腗IC分別是≤4 μg／mL、≤0.5 μg／mL、≤1 μg／mL、≤0.125 μg／mL、≤0.06 μg／mL。

表1 PU8、PU58、PU61的常規(guī)方法及分子方法鑒定結(jié)果Tab.1 Identification results of conventional and molecular methods for PU8，PU58 and PU61

3 討 論

格特隱球菌和新生隱球菌在臨床可以引起腦膜炎、肺炎等多種感染，其診斷主要是依靠墨汁染色、組織病理、真菌培養(yǎng)及鑒定、隱球菌抗原檢測等［6］。酵母菌的鑒定在臨床實(shí)驗(yàn)室的鑒定主要依靠Chromagar顯色培養(yǎng)基、API 20C、全自動微生物鑒定儀Vitek、Microscan等，然而對于新生隱球菌及格特隱球菌上述方法目前都是區(qū)分不開的，美國BD公司即將上市的BD PhoenixTM酵母菌鑒定板，同樣不能區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌。McTag?gart L等［5］用CGB培養(yǎng)基試驗(yàn)了123株隱球菌，結(jié)果27株格特隱球菌中有25株（93%）使CGB培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，其它隱球菌未使CGB培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色。Klein KR等［7］用CGB培養(yǎng)基測試了102株酵母菌，結(jié)果17株格特隱球菌全部使CGB培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，54株新生隱球菌均未將CGB培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，但有幾株其他隱球菌使CGB培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，其他酵母菌如1株近平滑念珠菌、1株阿薩希毛孢子菌和1株黏液毛孢子菌也使CGB培養(yǎng)基變了藍(lán)色。本試驗(yàn)中PU8和PU61均使CGB培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，兩株菌經(jīng)rDNA ITS和IGS序列分析均鑒定為格特隱球菌?？傊斜匾陔[球菌的常規(guī)鑒定中借助CGB培養(yǎng)基區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌。我們分析格特隱球菌在臨床上少見報(bào)到的原因一方面是該菌分布具有一定的區(qū)域性，但另一方面鑒定方法需要改進(jìn)或補(bǔ)充試驗(yàn)，如rDNA ITS或（和）IGS序列測定能很好的鑒定區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌［5］，測序成本目前也較為合理。從圖3和圖4可以看出PU8、PU58和PU61之間rD?NA ITS序列差異較小，而IGS序列差異較大，這也提示我們IGS序列相比ITS序列能夠更好地區(qū)分新生／格特隱球菌。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析（Matrix?Assisted Laser Desorption Ionization?Time?of?Flight Mass Spectrometry，MALDI?TOF MS）近年來在微生物鑒定等方面發(fā)展迅速，在短短幾分鐘內(nèi)就能將絕大多數(shù)微生物快速準(zhǔn)確地鑒定到種的水平［8］。本試驗(yàn)中MALDI?TOF MS使用的是法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，未能將兩株格特隱球菌準(zhǔn)確鑒定到種，提示該產(chǎn)品軟件在新生隱球菌和格特隱球菌的區(qū)分能力上有待升級。德國布魯克公司的MALDI?TOF MS能夠較好的區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌，F(xiàn)iracative C等［9］使用德國布魯克公司的MAL?DI?TOF MS不但準(zhǔn)確區(qū)分了164株新生隱球菌和格特隱球菌，而且還對試驗(yàn)菌株進(jìn)行了分子分型。

劉偉等［10］比較了 ATB FUNGUS 3與 CLSI M27?A2法對172株酵母菌臨床分離株的抗菌活性，得出結(jié)論ATB FUNGUS 3與CLSI推薦的微量肉湯稀釋法具有良好的一致性，20株新生隱球菌除了AMB有3株略有差異外，其余藥物的MIC基本一致。Li M等［11］使用微量肉湯稀釋法和ATB FUNGUS 3對52株新生隱球菌和9株格特隱球菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示不同種、不同基因型之間的體外藥敏試驗(yàn)沒有明顯差異。本研究試驗(yàn)菌株較少，致使格特隱球菌的藥敏結(jié)果不具代表性，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量。

新生隱球菌根據(jù)莢膜抗原不同被分為A、B、C、D和AD等5個血清型，依據(jù)分子生物學(xué)方法分類，新生隱球菌 （A、D和AD血清型）分為VNI、VNII、VNIII、VNIV和VNB等基因型，格特隱球菌（B和C血清型）分為VGI、VGII、VGIII和VGIV等基因型［12］。日本的隱球菌血清分型試劑已經(jīng)停產(chǎn)，目前隱球菌的基因分型取代了其血清分型，基因分型更加準(zhǔn)確并且有助于了解菌株之間基因差異以及地域的分布［13］。不同的基因型在流行病學(xué)，毒力特征，地理分布等方面均有所不同［1，6］。新生／格特隱球菌的基因分型現(xiàn)多采用多位點(diǎn)序列分型［14?15］（MLST），MLST是國際人獸真菌協(xié)會推薦［16］的用于新生／格特隱球菌的基因分型方法，該方法分辨力高，重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)共享與比對，并且不需要標(biāo)準(zhǔn)菌株。本研究報(bào)道的分離自河北地區(qū)的格特隱球菌分子分型、毒力特征以及流行病學(xué)等特點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

圖1 PU8（左）、PU58（中）及PU61（右）在Chromagar顯色培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48 h 圖2 PU8、PU58、PU61在CGB培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)5 d圖3 PU8、PU58和PU61之間rDNA ITS序列比較 圖4 PU8、PU58和PU61之間IGS序列比較Fig.1 Culture of PU8（left），PU58（middle）and PU61（right）on Chromagar at 35℃ for 48 h Fig.2 Culture of PU8，PU58 and PU61 on CGB at 35℃ for five days Fig.3 Comparision of sequences for rDNA among PU8，PU58 and PU61 Fig.4 Comparision of IGS sequences among PU8，PU58 and PU61

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Clinical presentation and laboratory study for a case of cryptococcal meningitis caused by Cryptococcus gattii in Hebei province

DOU Hong?tao1，WAN Zhe2，YANG Qi?wen1，WANG Yao1，WANG He1，XIE Xiu?li1，LIU Juan1，LI Ruo?yu2，XU Ying?chun1
（1.Department of clinical laboratory，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy Of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China；2.Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Research Center for Mycology，Peking University，Beijing 100034，China）

Objective To report a case of meningitis caused byCryptococcus gattiiin North China and related laboratory investi?gation.Methods The strain isolated from the patient mentioned above was inoculated on the Chromagar media and Canavanine?gly?cine?bromthymol blue（CGB）media at 35℃.API 20C AUX、Vitek 2 Compact、Matrix?Assisted Laser Desorption Ionization?Time?of?Flight Mass Spectrometry（MALDI?TOF MS）、ribosomal ITS and IGS sequence analysis were performed for identification.Antifungal susceptibility test was also performed with ATB FUNGUS 3.Results The color of the strain on the Chromagar media was colorless and slight pink.It turned the CGB media blue five days later.It was identified asCryptococcus neoformansby API 20C AUX、Vitek 2 Compact and MALDI?TOF MS.It was considered asCryptococcus gattiiby sequence analysis of genes of ribosomal ITS and IGS.The minimal inhibitory concentrations of 5?Flucytosine、AmphotericinB、Fluconazole、Voriconazole、Itriconazole against the isolate were≤4 μg／mL、≤0.5 μg／mL、≤1 μg／mL、≤0.125 μg／mL、≤0.06 μg／mL respectively.Conclusions CGB media、ribosomal ITS and IGS sequence analysis can discriminateCryptococcus gattiifromCryptococcus neoformans.CGB is an easy method to identifyC.gattii.I?solation and identification ofC.gattiineed to be paid more attention.

Cryptococcus gattii；Hebei province；CGB media；identification；sequencing；antifungal susceptibility test

R 519.4

A

1673?3827（2015）10?0011?05

2014?12?07

［本文編輯］ 施 慧

首都臨床特色應(yīng)用研究（Z141107006614006）

竇紅濤，男（漢族），碩士，副主任技師.E?mail：hongtaodou＠sina.com

徐英春，E?mail：xycpumch＠139.com