多聚泛素UBI4低表達對新生隱球菌生長與毒力的功能影響

孟云芳1 周兆婧1 楊雅驪1 趙靜宇1，2 張超1 法振宗1 桑軍軍1 方偉1 廖萬清1

（1.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點實驗室第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海200003；2.上海市皮膚病醫(yī)院，上海200050）

多聚泛素UBI4低表達對新生隱球菌生長與毒力的功能影響

孟云芳1 周兆婧1 楊雅驪1 趙靜宇1，2 張超1 法振宗1 桑軍軍1 方偉1 廖萬清1

（1.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點實驗室第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海200003；2.上海市皮膚病醫(yī)院，上海200050）

目的 構建新生隱球菌的多聚泛素UBI4低表達菌株，檢測UBI4低表達對新生隱球菌生長和毒力的功能影響。方法 采用融合PCR方法，擴增含有UBI4基因的片段，將其與含有組蛋白啟動子的質(zhì)粒融合。通過基因槍將重組質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)化入新生隱球菌，應用PCR篩選、DNA序列測序以及實時定量PCR方法對基因重建株進行鑒定與驗證。檢測多聚泛素UBI4低表達菌株對多種應激耐受力、生長曲線以及對蠟蛾感染的毒力影響。結(jié)果 成功構建了新生隱球菌多聚泛素UBI4低表達。表型檢測結(jié)果提示：較之標準株，UBI4低表達株生長速率下降，對高溫、H2O2和NO應激以及多種抗真菌藥物敏感性顯著增強；同時，UBI4下調(diào)表達后隱球菌對蠟蛾的毒力顯著下調(diào)。結(jié)論 我們的研究初步證實多聚泛素蛋白UBI4對新生隱球菌的生長增殖、應激應答以及感染能力具有重要的調(diào)控作用，為后續(xù)深入探討新生隱球菌泛素系統(tǒng)的功能機制奠定基礎。

新生隱球菌；多聚泛素；致病機制；應激應答。

［Chin J Mycol，2015，10（1）：16?21］

新生隱球菌 （Cryptococcus neoformans）是臨床上最重要的機會感染性病原菌之一，可感染免疫功能受損患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，常引發(fā)具有致命威脅的隱球菌性腦膜腦炎。近年來隨著器官移植、抗腫瘤藥物、糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的廣泛應用以及HIV感染率的逐年增加，免疫功能受損人群日漸增多，新生隱球菌發(fā)病率也呈現(xiàn)出一定的上升趨勢。

泛素是真核生物中普遍存在的一種高度保守蛋白，可通過標記靶蛋白介導蛋白質(zhì)降解活動，這個過程稱為“泛素化”，參與調(diào)控真核細胞的應激應答、有性繁殖、信號轉(zhuǎn)導等多種重要的生物學過程［1］。新生隱球菌有兩個泛素編碼基因：UBI1和UBI4，其中UBI4編碼含5個泛素單體的多聚泛素蛋白［2］，其功能機制尚不明確。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，?去泛素化酶Ubp5對新生隱球菌的生長和毒力具有多效調(diào)控作用［3］，我們推測其功能機制可能在于維系細胞內(nèi)泛素水平的穩(wěn)態(tài)。在此基礎上，我們曾試圖敲除多聚泛素基因UBI4但始終未能獲得基因缺陷株。本研究中，我們擬構建隱球菌多聚泛素UBI4高表達菌株，意外得到低表達菌株，通過檢測該菌株的生長與毒力表型改變，初步探索了該基因在新生隱球菌生長與感染過程中的功能機制。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株與質(zhì)粒 本研究中以本實驗室保藏的新生隱球菌（C.neoformans var.grubbii，VNI）H99為背主要儀器和設備 Eppendorf移液器、搖床、水浴鍋、BioRad PCR儀、真空泵凍干機、BiaRad基因槍、BioRad超速離心機等。

1.2 實驗方法

多聚泛素基因UBI4高表達質(zhì)粒的構建 應用PCR方法用引物 UBI4?F／R（其中5‘端均含有景菌株；應用的質(zhì)粒為含有NAT抗性基因的質(zhì)粒pCH20，為美國杜克大學John Perfect教授贈送。

培養(yǎng)基與主要試劑 基礎培養(yǎng)基為 YPD、YNB、LB［3］。

以YPD固體培養(yǎng)基為基礎，加入1 mol／L山梨醇（細胞膜保護劑）用于基因槍轉(zhuǎn)化后菌株的修復生長，加入抗生素100 mg／L諾爾斯菌素用于篩選基因重建菌株陽性克隆子；分別加入0.02%SDS、0.1%咖啡因、0.5%剛果紅、1.5 mol／L NaCl、1.5 mol／L KCL用于檢測各菌株對各種應激的敏感性；YNB培養(yǎng)基中分別加入2 μmol／L H2O2、0.75 μmol／L NaNO2用以檢測基因重建菌株及野生菌株對氧化應激和NO應激的敏感性；LB液體培養(yǎng)基中加入100 mg／L氨芐青霉素或卡那霉素用以培養(yǎng)含有基因UBI4高表達質(zhì)粒的大腸桿菌。

實驗中用到的山梨醇、SDS、咖啡因、剛果紅、NaCl、KCl等試劑均購買自上海生工生物工程股份有限公司，諾爾斯菌霉素購買自Sigma?aldrich公司，Primestar DNA聚合酶等PCR相關試劑購買自Takara公司，酵母基因組抽提等試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，所有引物序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成（見表1）。BamH I酶切位點）從隱球菌基因組上PCR擴增目的基因片段（含開放讀碼框架區(qū)和終止子區(qū)），預期DNA片段為2 470 bp（見圖1a），將獲得的UBI4 DNA片段和質(zhì)粒pCH20經(jīng)核酸內(nèi)切酶BamH I處理后，用In?Fusion PCR Cloning試劑盒融合構建新的質(zhì)粒載體pH3（p）：：UBI4并用引物UBI4nb?f和Nat Probe F驗證，目的片段應為1 750 bp。

基因槍轉(zhuǎn)化 挑取標準株H99單克隆接入液體YPD培養(yǎng)基，在30℃搖床中以220 r／min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜。將上述方法得到的感受態(tài)細胞經(jīng)無菌水清洗三遍后定量，取500 μL涂布在1 mol／L山梨醇＋YPD培養(yǎng)基上，常溫晾干備用。把準備好的質(zhì)粒與10 mL金珠、10 mL CaC12（2.5 mol／L）和2.5 mL亞精胺（1 mol／L）用渦輪振蕩器混勻，混勻物靜置10 min后用100 mL 100%乙醇重懸離心，得到的沉淀用12 mL 100%乙醇重懸并均勻涂布于載粒膜上風干。用基因槍通過高壓將載粒膜上的DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞。30℃培養(yǎng)箱孵育4 h后轉(zhuǎn)移至YPD＋諾爾斯菌素培養(yǎng)基上孵育3～7 d。

陽性克隆的篩選與驗證 從上述抗性培養(yǎng)基上挑取單克隆抽取DNA，用引物UBI4nb?f和Nat Probe F驗證陽性克隆（見圖1b），將陽性PCR產(chǎn)物送公司測序，測序正確的菌株進一步應用實時定量PCR檢測。將待測菌株在液體YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，離心收菌后凍干，用試劑盒抽提RNA后保存在?80℃冰箱備用；用 SuperScript III First?Strand Synthesis Kit for RT?PCR試劑盒合成cDNA（具體操作詳見說明書）；以GPD1基因作為內(nèi)參，將獲得的cDNA模板應用引物UBI4?a／b做實時定量PCR檢測，每個反應重復三次，取平均值。通過上述方法檢測正確的菌株進一步用于后續(xù)的表型和毒力檢測。

生長曲線檢測 將待測菌株取單克隆菌落接入YPD液體培養(yǎng)基，搖床過夜培養(yǎng)；經(jīng)血色球計數(shù)板計數(shù)定量，取106CFU入30 mL新鮮YPD培養(yǎng)基中，30℃和37℃搖床中培養(yǎng)（250 r／min）；每4 h以分光光度計檢測其OD600值，5～7 d后繪成生長曲線。

體外應激應答反應檢測 將待測菌株在30℃搖床孵育過夜，離心收菌并以無菌水清洗兩遍，調(diào)整至相同濃度，然后用PBS連續(xù)稀釋 （1～106）后分別取3 mL菌懸液接種于各種應激培養(yǎng)基上，晾干后放在30℃孵箱孵育3～7 d后拍照。

抗真菌藥敏實驗 根據(jù)NCCLS protocol M?27A操作［4］。待測菌株提前在YPD固定培養(yǎng)基上孵育2～3 d，按照指南要求將抗真菌藥物稀釋：兩性霉素B濃度為160～0.313 g／mL，卡泊芬凈、氟康唑、氟胞嘧啶濃度均為640～1.25 g／mL。待測菌株用無菌水清洗后稀釋到（1～5）×106細胞／mL，然后用生理鹽水稀釋100倍，再用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋20倍后到（0.5～2.5）×103細胞／mL。把菌懸液加到配好的抗菌藥物中，30℃孵育48 h后檢測最小抑菌濃度（見表2）。

表2 多種抗真菌藥物的最小抑菌濃度Tab.2 In vitro susceptibility of strains to four antifungal agents

蠟蛾實驗 待測菌株定量至濃度為5×107細胞／L，挑選體重為（330±25）mg的蠟蛾隨機分到H99組、H99His?UBI4組和PBS組。酒精棉球擦拭蠟蛾腹部，用10 mL Hamilton注射器在蠟蛾最后一只左前足注入血腔5 mL菌懸液，完畢后放置蠟蛾于黑暗處，每日查看每組蠟蛾死亡數(shù)。統(tǒng)計學上以Ka?plan?Meier生存曲線表示，并以Log rank test（SPSS 18.0）完成統(tǒng)計學分析，以P＜0.05作為衡量是否具有統(tǒng)計學差異的標準。

2 結(jié) 果

2.1 多聚泛素UBI4基因重建株的構建與驗證

由于前期研究中，我們一直無法獲得多聚泛素UBI4的基因缺陷株，本研究擬通過構建強啟動子（Histone啟動子）驅(qū)動的UBI4表達質(zhì)粒，繼而轉(zhuǎn)化隱球菌獲得其高表達菌株。首先我們通過PCR獲得多聚泛素基因中剔除啟動子的DNA片段，PCR產(chǎn)物電泳如圖1a，條帶大小符合預期，經(jīng)測序（結(jié)果未展示）提示片段完全正確。在此基礎，我們成功將該片段應用Infusion?PCR試劑盒插入pCH20質(zhì)粒，該重建質(zhì)粒經(jīng)煮菌PCR（見圖1b）和PCR產(chǎn)物測序（結(jié)果未展示）檢驗后完全正確。將該質(zhì)粒以基因槍轉(zhuǎn)入新生隱球菌，經(jīng)抗性培養(yǎng)基初步獲得若干陽性克隆子，經(jīng)PCR和DNA測序初步驗證，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功（見圖1c）。

我們進一步應用RT?PCR方法來檢測對比基因UBI4在標準株H99和H99His?UBI4的表達水平，結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)UBI4基因在H99His?UBI4的表達水平不僅沒有上升反而顯著下降（見圖1d），提示我們新生隱球菌中多聚泛素基因存在復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，過度表達可能導致隱球菌無法正常地生長或存活，其機制尚有待于進一步探索。

2.2 多聚泛素UBI4參與隱球菌應激應答反應

我們進一步檢測了多聚泛素UBI4低表達菌株對多種環(huán)境應激的耐受性。

通過比較UBI4低表達菌株與標準株H99在30℃、37℃和39℃的生長情況，發(fā)現(xiàn)前者在30℃培養(yǎng)時即表現(xiàn)出輕度的生長缺陷，37℃時生長缺陷加重，39℃時則幾乎被生長抑制。在氧化應激 （2 mmol／L H2O2）和NO應激（0.75 mmol／L NaNO2）檢測實驗中，H99His?UBI4敏感性顯著增強；同時，對高鹽離子（1.5 mol／L NaCl、1.5 mol／L KCl）和高滲透壓（1.5 mol／L山梨醇）敏感性也較標準株明顯增強，對細胞壁 （0.02%SDS、0.1%咖啡因）、細胞膜（0.5%剛果紅）應激反應也表現(xiàn)出更高的敏感性（見圖2）。因此，多聚泛素UBI4可能參與了隱球菌對多種應激反應的調(diào)控。

由于近年來隱球菌出現(xiàn)了越來越多的耐藥性，我們依據(jù)國際通用的標準抗真菌藥敏實驗操作指南 Cinical and Laboratory Standards Institute broth microdilution reference method（NCCLS）檢測了UBI4下調(diào)表達對新生隱球菌對抗真菌藥物耐力的影響［5］?？紤]到 H99His?UBI4對高溫敏感，所有菌株在30℃下孵育。與標準株H99相比，H99His?UBI4對各種藥物敏感性顯著增強，對兩性霉素B最小抑菌濃度下降50%，對氟胞嘧啶、氟康唑和卡泊芬凈均有下降75%（見表2）。質(zhì)控菌株Candida parapsi?Losis（ATCC22019）對抗菌藥物的最小抑菌濃度符合操作指南要求。

綜上所述，多聚泛素UBI4對新生隱球菌的應激應答具有重要的調(diào)控作用，多聚泛素UBI4低表達導致隱球菌對高溫、氧化和NO應激、高滲環(huán)境、胞膜／胞壁應激以及多種抗真菌藥物的增強，這提示多聚泛素UBI4對隱球菌適應人體等宿主環(huán)境具有非常重要的正向調(diào)控作用。

2.3 多聚泛素UBI4調(diào)控新生隱球菌細胞增殖

由于H99His?UBI4即使在30℃和YPD培養(yǎng)基上也有明顯生長缺陷，我們進一步評估其對隱球菌細胞增殖的影響。結(jié)果顯示：標準株H99在30℃經(jīng)過4 h生長停滯期后迅入指數(shù)生長期，約40 h后到達平臺期。而 H99His?UBI420 h后才進入指數(shù)生長期，約 60 h后進入平臺期。在 37℃環(huán)境下，H99His?UBI4經(jīng)過約80 h后才進入指數(shù)生長期，120 h后到達平臺期。另外，此前實驗結(jié)果顯示H99His?UBI4即使在30℃生長時單克隆也較標準株小，可能與較低的細胞增殖速率有關。因此，多聚泛素UBI4參與新生隱球菌細胞增殖的調(diào)控（見圖3a，3b）。

2.4 多聚泛素UBI4低表達對新生隱球菌毒力的影響

蠟蛾是一種簡易的動物模型，為了檢測多聚泛素UBI4在新生隱球菌致病感染過程中的功能機制，我們構建了蠟蛾感染模型。實驗結(jié)果顯示，截止感染后20 d，H99感染組約93.3%的蠟蛾死亡，而H99His?UBI4感染組僅26.7%的蠟蛾死亡，其存活率顯著高于標準株組（P＜0.000 1）表現(xiàn)死亡率明顯下降（見圖3c）；而與PBS組相比時，兩組無顯著的統(tǒng)計學差異 （P＝0.145）。重復實驗結(jié)果一致，提示多聚泛素UBI4對新生隱球菌毒力具有重要的調(diào)控作用。

3 討 論

泛素系統(tǒng)是真核生物體中重要的蛋白修飾和蛋白降解系統(tǒng)，參與調(diào)控細胞內(nèi)多種多樣的生物學過程，如細胞周期、信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復以及應激反應等。在過去的幾十年里，關于模式酵母和病原真菌泛素系統(tǒng)的功能與調(diào)控機制方面的研究依然取得了重要的進展。在釀酒酵母中存在四個泛素編碼基因UBI1?UBI4，其中UBI1?UBI3在細胞指數(shù)生長期表達，UBI4編碼多聚泛素蛋白，參與調(diào)控釀酒的營養(yǎng)代謝、應激應答、有性繁殖等多種重要的生物學過程［6?7］。在病原酵母白念珠菌的泛素功能研究中發(fā)現(xiàn)，多聚泛素Ubi4p對其細胞形態(tài)、生長周期、應激應答、營養(yǎng)代謝等多種重要的生物學過程，對白念株菌毒力發(fā)揮重要的調(diào)控作用［8］。

在新生隱球菌中，泛素系統(tǒng)的結(jié)構和功能尚無系統(tǒng)的研究報道。有學者比較了隱球菌在高滲條件、氧化應激以及抗真菌藥物咯菌腈等環(huán)境中基因表達模式的變化，發(fā)現(xiàn)大量的泛素系統(tǒng)相關基因（其中含有多聚泛素UBI4）可能參與了細胞對環(huán)境應激的應答反應調(diào)控［9］。本課題組在前期研究中證實，去泛素化酶Ubp5p不僅調(diào)控新生隱球菌高溫耐受、黑色素酶與莢膜等多種毒力因子的產(chǎn)生，而且參與隱球菌的應激應答反應、細胞周期、有性繁殖等多種重要的生物學過程。去泛素化酶的主要功能在于維持細胞內(nèi)泛素水平的穩(wěn)態(tài)，我們推測去泛素化酶Ubp5p可能與泛素前體蛋白 （尤其是多聚泛素Ubi4p）作用于同一通路以共同調(diào)節(jié)胞內(nèi)的泛素水平的動態(tài)平衡。

由于前期工作多次嘗試敲除新生隱球菌的多聚泛素編碼基因UBI4，均未獲得成功；本研究中意外獲得其下調(diào)表達菌株，我們推測可能Histone啟動子驅(qū)動的UBI4高表達或蛋白過度泛素化會造成隱球菌細胞出現(xiàn)未知的細胞損傷，為了避免這種損傷可能由某些信號分子反饋性抑制基因UBI4的轉(zhuǎn)錄表達，這種調(diào)控機制尚有待于進一步探索。與此同時，多聚泛素的表達下調(diào)使得隱球菌細胞對多種應激原（高溫、H2O2和NO應激、胞壁損傷等）和抗真菌藥物耐受力顯著下降、生長速度下降，對蠟蛾感染毒力顯著下降，這提示我們：多聚泛素直接參與對隱球菌細胞增殖、應激應答等生物學過程，并對其毒力發(fā)揮重要的調(diào)控作用。UBI4是新生隱球菌應激條件下的主要泛素編碼基因，可通過有效生產(chǎn)多聚泛素前體蛋白以不斷補充應激條件下的泛素消耗，而其功能機制與去泛素化酶的輔助功能密不可分，其內(nèi)在的相關作用關系與分子機制尚有待于進一步探索。

大量的研究證明多種信號轉(zhuǎn)導通路如絲裂原活化蛋白激酶途徑 （MAPK）、高滲透壓甘油途徑（HOG）、鈣離子／鈣調(diào)磷酸酶 （Calcineurin）途徑協(xié)同調(diào)節(jié)新生隱球菌的應激應答、有性繁殖以及毒力因子分泌［10?11］。而泛素系統(tǒng)已證實對這些信號轉(zhuǎn)導通路具有重要的調(diào)節(jié)作用［12?13］。例如，泛素系統(tǒng)通過選擇性降解釀酒酵母中高滲透壓甘油途徑上游的調(diào)控蛋白元件Ssk1的降解而下降HOG通路。深入研究泛素系統(tǒng)與多種通路之間復雜的相互作用關系及其對隱球菌毒力的功能影響，對于我們進一步解析隱球菌致病感染的分子生物學機制十分重要。

圖1 a.擴增UBI 4基因片段；b.用引物UBI4?f和Nat Probe F做煮菌PCR驗證pH3（p）：：UBI 4?1／2；c.用引物UBI4nb?f和Nat Probe F驗證H99H3（p）：：UBI4，圖示b和c均為陽性電泳條帶（引物序列見表1）；c.多聚泛素基因UBI 4在基因重建株中表達下調(diào) 圖2 H99H3（p）：：UBI4對各種應激應答反應敏感性增高。H99和H99H3（p）：：UBI4菌株在30℃下液體YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和，連續(xù)稀釋后取3 μL菌懸液滴在各種應激培養(yǎng)基上，晾干后放置30℃培養(yǎng)箱孵育3～5 d后拍照 圖3 生長曲線與蠟蛾感染模型A＆B。H99和H99H3（p）：：UBI4菌株分別在30℃液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后細胞計數(shù)定量，將定量后的菌懸液轉(zhuǎn)到30 mL新鮮YPD液體培養(yǎng)基，每4 h測量一次OD值。30℃（a）and 37℃ （b）。H99H3（p）：：UBI4在30℃即表現(xiàn)出生長緩慢，高溫37℃加重了生長缺陷；c.蠟蛾模型體外毒力實驗。H99H3（p）：：UBI4感染的蠟蛾死亡率顯著下降Fig.1 a.UBI 4 gene DNA fragment was amplified B＆C Confirmation of positive transformants by diagnostic PCR；d.Expression of UBI 4 was down reg?ulated in H99H3（p）：：UBI4 Fig.2 H99H3（p）：：UBI4 is involved in various stress responses of C.neoformans Fig.3 Growth rate measurementsin the ubp5 mutant and in vivo virulence assay in G.mellonella

隱球菌對現(xiàn)有抗真菌藥物的耐藥性是當前困擾臨床治療的一個棘手問題。兩性霉素B療效確切，然而其極大的藥物毒副作用對很多基礎情況不佳的患者是個重大的考驗；氟康唑可以透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是臨床為數(shù)不多可用于隱球菌感染治療的可選藥物，然而其臨床耐藥株已然出現(xiàn)；而新型棘白球素類抗真菌藥物卻缺乏抗隱球菌感染的療效。臨床耐藥性進一步增進了研發(fā)新的安全高效抗真菌藥物的迫切需要。值得重視的是，泛素系統(tǒng)蛋白元件是當前抗腫瘤治療的一個熱點研究方向［14］。泛素系統(tǒng)對新生隱球菌生長繁殖、應激應答、致病感染具有多重調(diào)控作用，也為我們探索新的藥物干預靶點提供了新的研究方向。

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Effects of polyubiquitin UBI4 downregulation on growth and pathogenesis of Cryptococcus neoformans

MENG Yun?fang1，ZHOU Zhao?jing1，YANG Ya?li1，ZHAO Jing?yu1，2，ZHANG Chao1，F(xiàn)A Zhen?zong1，SANG Jun?jun1，F(xiàn)ANG Wei1，LIAO Wan?qing1
（1.Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology and PLA Key Laboratory of Fungal Diseases，Department of Dermatology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China；2.Shanghai Dermatology Hospital，Shanghai 200003，China）

Objective To construct Cryptococcus neoformans strain with downregulated UBI4 expression and examine the effects of UBI4 downregulation on growth and pathogenesis of C.neoformans.Methods UBI4 DNA fragment was amplified and infused into linear plasmid pCH20 containing histone promoter.The fused plasmid was then transformed intoC.neoformansthrough gene gun.The positive transformants were screened by diagnostic PCR and DNA sequencing.Various phenotype of C.neoformans reconstituted strain H99His?UBI4were examined.Results Cryptococcus neoformans strain with low expression of UBI4 were constructed and phenotypic as?says demonstrated that down?regulated UBI4 lead to slower growth rate and enhanced susceptibility to various stresses such as H2O2，NO and antifungal agents in C.neoformans.Moreover，C.neoformans with down?regulated UBI4 was also attenuated dramatically in wax moth infection model.Conclusion Our study suggested that polyubiquitin UBI4 played a critical role in cell proliferation，stress re?sponse and pathogenesis in C.neoformans.Our work laid a foundation for following studies about functions and mechanisms of ubiquit?in system.

Cryptococcus neoformans；polyubiquitin；pathogenesis；stress response

R 379.5

A

1673?3827（2015）10?0016?06

2015?01?04

［本文編輯］ 衛(wèi)鳳蓮

國家973項目 （2013CB531601）；上海市自然科學基金（12ZR1454400，12JC1411000）；上海市醫(yī)學真菌分子生物學實驗室基金（14DZ2272900）

孟云芳，女（漢族），博士研究生在讀.E?mail：mengyun?fang6.12＠163.com；周兆婧，女（漢族），碩士研究生在讀.E?mail：zhouzhaojing320＠163.com

廖萬清，E?mail：Liaowanqing＠sohu.com；方偉，E?mail：we?ifang081782＠163.com