基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的基因突變檢測(cè)在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李靖軒，金益如，徐吟秋，宋沁馨*，周國(guó)華

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210009；2. 中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京210009；3. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，江蘇 南京210002）

基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的基因突變檢測(cè)在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李靖軒1，2，金益如1，2，徐吟秋1，2，宋沁馨1，2*，周國(guó)華3

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210009；2. 中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京210009；3. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，江蘇 南京210002）

基因突變檢測(cè)在腫瘤等疾病的早期診斷、個(gè)體化給藥指導(dǎo)、疾病治療進(jìn)程與耐藥監(jiān)控等方面具有極其重要的意義。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA突變的檢測(cè)與分析已為病毒感染、血液病和實(shí)體瘤等疾病的個(gè)體化診治提供重要參考。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一種基于生物發(fā)光法測(cè)定焦磷酸鹽的實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)，其用于DNA序列分析時(shí)不需電泳和熒光標(biāo)記，定量性能好，結(jié)果準(zhǔn)確，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，在基因突變檢測(cè)分析與腫瘤等疾病診治中發(fā)揮巨大作用。綜述基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的基因突變檢測(cè)在分子靶向個(gè)體化治療和疾病診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

焦磷酸測(cè)序；基因突變；個(gè)體化治療；疾病診斷

基因突變?cè)谀[瘤等其他疾病的發(fā)生、發(fā)展以及治療過程中產(chǎn)生耐藥等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，而腫瘤的特征之一就是人基因組的不穩(wěn)定性和突變［1］。因此，基因突變的檢測(cè)在腫瘤早期診斷、指導(dǎo)個(gè)體化給藥、監(jiān)控治療進(jìn)程中耐藥發(fā)生等方面具有極其重要的意義［2］。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，在個(gè)體化腫瘤診治領(lǐng)域，DNA突變的檢測(cè)與分析已經(jīng)為很多實(shí)體腫瘤和惡性血液病的個(gè)體化治療提供了重要參考。例如：在應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）以及抗表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）單抗治療結(jié)直腸癌（CRC）前，首先對(duì) EGFR 和KRAS 基因的突變情況進(jìn)行檢測(cè)分析［3］；此外，乳頭狀甲狀腺癌和轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤 BRAF 基因V600E突變靶向藥物維羅非尼（vemurafenib）在用于腫瘤的診治過程中，均需通過

基因測(cè)序來檢測(cè)患者BRAF 基因V600E突變狀況，從而判斷藥物適用與否。

焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）技術(shù)（Ronaghi等，Science， 1998年）是基于單個(gè)堿基逐個(gè)延伸反應(yīng)的原理，可以克服Sanger測(cè)序法（雙脫氧核苷酸鏈終止法）的缺點(diǎn)，是Sanger測(cè)序法的重要補(bǔ)充。其原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶等4種酶的協(xié)同作用下，引物上每一個(gè)脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。采用該技術(shù)進(jìn)行DNA序列分析時(shí)，不需電泳或熒光標(biāo)記，可以直接測(cè)定引物后面的堿基序列，定量性能好，結(jié)果準(zhǔn)確，適合對(duì)大樣本進(jìn)行快速檢測(cè)，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。因此，焦磷酸測(cè)序技術(shù)在基因突變檢測(cè)分析與腫瘤診斷和治療中可發(fā)揮巨大作用。

1 基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的基因突變檢測(cè)在分子靶向個(gè)體化治療中的應(yīng)用研究

1.1 指導(dǎo)肺癌靶向治療的基因突變檢測(cè)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，而NSCLC約占肺癌病例的80%～85%，其1/3患者在初次確診時(shí)已經(jīng)處于局部晚期，錯(cuò)過手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，中位數(shù)生存期僅4～5個(gè)月［4］。以手術(shù)、化療和放療為主的傳統(tǒng)治療方法如今已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)瓶頸期，而分子靶向治療正逐漸成為晚期NSCLC的重要治療手段。以表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）為代表的分子靶向治療可延長(zhǎng)NSCLC患者的生存期，但是EGFR-TKI的療效與EGFR或KRAS基因突變密切相關(guān)：EGFR基因18、19、21號(hào)外顯子突變是EGFRTKI的敏感指標(biāo)，而EGFR基因20號(hào)外顯子T790M突變和KRAS基因突變則是EGFR-TKI的耐藥指標(biāo)［5］。因此，在接受EGFR-TKI治療前進(jìn)行EGFR/KRAS基因檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)靶向治療非常重要。

Tsiatis等［6］應(yīng)用Sanger測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法和高分辨率熔解曲線（HRM）法對(duì)180例甲醛溶液固定樣本和石蠟包埋樣本（其中，58例未轉(zhuǎn)移CRC，42例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，63例未轉(zhuǎn)移和17例轉(zhuǎn)移性肺腺癌）和20個(gè)正常結(jié)腸樣本的KRAS基因12、13號(hào)密碼子的突變進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，180例癌癥樣本中62.2%的KRAS基因發(fā)生突變，37. 8%未發(fā)生突變。其中，HRM法檢測(cè)時(shí)，有10%的樣本并不能給出明確的結(jié)論，但并未發(fā)生陽(yáng)性或陰性的檢測(cè)錯(cuò)誤；焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)時(shí)，也未發(fā)生陽(yáng)性或陰性檢測(cè)錯(cuò)誤；Sanger測(cè)序法檢測(cè)時(shí)，有11.1%的陽(yáng)性和6. 1%的陰性檢測(cè)錯(cuò)誤。此外，該研究發(fā)現(xiàn)，Sanger測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法和HRM法的檢測(cè)靈敏度分別約為15%～20% 、5%和10%的等位基因突變。

Kim等［7］應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)202例肺癌患者的石蠟包埋樣本EGFR基因18～21號(hào)外顯子突變，結(jié)果顯示，樣本EGFR基因突變率為26.7%（54/202），其中女性（與男性相比，52.1% vs 13.0%）、不抽煙者（與抽煙者相比，47.8 % vs 15.8%）、腺癌（與非腺癌相比，35.2% vs 5.2%）樣本中活性EGFR基因突變更為常見；EGFR基因突變與對(duì)EGFR-TKI藥物的反應(yīng)密切相關(guān)，具有EGFR基因活性突變和野生型的患者對(duì)藥物敏感性分別為82.4%和5.9%；而且在臨床治療過程中，女性、不吸煙和腺癌的患者其療效均好于男性、吸煙和非腺癌的患者。此研究表明，EGFR基因突變與良好的臨床參數(shù)指標(biāo)（女性、不吸煙、腺癌等）在預(yù)測(cè)疾病治療效果的時(shí)候有良好的一致性和相關(guān)性；焦磷酸測(cè)序技術(shù)不僅可以檢測(cè)石蠟包埋組織中的基因突變，還能很好地預(yù)測(cè)臨床上患者對(duì)EGFR-TKI治療的響應(yīng)?？梢?，焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一個(gè)靈敏、快速、簡(jiǎn)單的基因測(cè)序平臺(tái)。

Ulivi等［8］在探索基因突變檢測(cè)的最優(yōu)樣本來源時(shí)，應(yīng)用直接測(cè)序法和焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)疑似NSCLC患者新鮮和固定后的縱膈淋巴結(jié)及附近組織中EGFR和KRAS基因突變，并將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。32名患者（25名為腺癌，7名為鱗狀細(xì)胞癌）的EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果：新鮮組織中2例陽(yáng)性，固定后組織中3例陽(yáng)性；KRAS基因突變檢測(cè)結(jié)果：新鮮組織中8例陽(yáng)性，固定后組織中9例陽(yáng)性。該研究表明，相較于新鮮組織，固定和染色后的樣本更易于分子檢測(cè)，究其原因，可能是新鮮組織中大量非腫瘤細(xì)胞的存在影響了檢測(cè)結(jié)果。

NSCLC分子靶點(diǎn)EGFR或KRAS的基因檢測(cè)大多需要腫瘤組織樣本。然而，臨床上經(jīng)常遇到無法獲得腫瘤組織樣本的情況，使得EGFR或KRAS基因檢測(cè)難以開展，限制了NSCLC患者的分子靶向治療選擇。因此，探索組織樣本的良好替代物及檢測(cè)方法至關(guān)重要。

Akca等［9］應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)52例NSCLC患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA樣本的EGFR基因突變，其間，經(jīng)焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)的所有血清DNA突變樣本，均用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證，并用同一患者的石蠟包埋組織進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果，從血清DNA中檢測(cè)到21例（40.4%）樣本存在EGFR基因突變，其中，14例為E746-A750缺失，2例為E747-A750缺失，5例為L(zhǎng)858R突變；石蠟包埋組織檢測(cè)到25例（48.1%）樣本存在EGFR突變，其中，17例為E746-A750缺失，2例為E747-A750缺失，6例為L(zhǎng)858R突變；Sanger測(cè)序法檢測(cè)到21例（40.4%）樣本存在EGFR突變，其中，14例為E746-A750缺失，2例為E747-A750缺失，5例為L(zhǎng)858R突變。此外，還發(fā)現(xiàn)，腺癌患者的EGFR基因突變率（24/36， 66.7%）比鱗狀細(xì)胞癌患者（1/16， 6.3%）更高。該研究表明，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可有效用于檢測(cè)早期NSCLC患者血清DNA的EGFR突變，且在檢測(cè)EGFR突變時(shí)，焦磷酸測(cè)序技術(shù)較Sanger測(cè)序法更靈敏，其靈敏度足以實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中DNA和石蠟包埋組織中DNA的檢測(cè)。

孫潔等［10］收集了63例晚期NSCLC患者的外周血標(biāo)本，分離血漿并提取DNA，采用巢式PCR結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)KRAS基因12和13號(hào)密碼子的突變。結(jié)果顯示，63例NSCLC患者中，3例（4.76%）KRAS基因突變陽(yáng)性，其中，2例是12號(hào)密碼子突變，1例是13號(hào)密碼子突變；患者血漿KRAS突變率均較低，與文獻(xiàn)報(bào)道的亞裔組織KRAS突變率一致，低于西方人的KRAS突變率。

1.2 指導(dǎo)結(jié)直腸癌靶向治療的基因突變檢測(cè)

CRC是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，而KRAS基因突變?cè)贑RC形成過程中起重要作用。近年來的研究表明，KRAS基因突變狀況與CRC預(yù)后密切關(guān)聯(lián)，是判斷CRC患者預(yù)后的重要指標(biāo)［11］。而且，分子靶向藥物EGFR抑制劑西妥昔單抗（cetuximab）治療晚期CRC的效果與患者KRAS基因是否突變極為有關(guān)：KRAS基因野生型患者對(duì)西妥昔單抗敏感，而KRAS基因突變型患者對(duì)其不敏感。因此，KRAS基因是否突變可以作為西妥昔單抗的用藥判斷標(biāo)準(zhǔn)［12］。于是，快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)KRAS基因突變狀況，有助于臨床上合理、精準(zhǔn)制定CRC治療方案。

王樹新等［13］欲探索不同的方法檢測(cè)CRC組織中KRAS基因點(diǎn)突變的差異，分別采用焦磷酸測(cè)序法和雙脫氧測(cè)序法檢測(cè)60例CRC患者石蠟包埋組織樣本中KRAS基因的第12和14號(hào)密碼子，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示，兩種方法均能夠檢測(cè)到KRAS基因突變，但是靈敏度各有不同：兩種方法對(duì)5例樣本的檢測(cè)結(jié)果不一致；焦磷酸測(cè)序法和雙脫氧測(cè)序法分別檢測(cè)出20例（33.3%）和15例（25%）KRAS基因突變，前者檢出率高于后者。對(duì)腫瘤細(xì)胞的病理分析發(fā)現(xiàn)，5例雙脫氧測(cè)序法漏檢的樣本中均有較多的炎癥細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞則較少，不足20%，這可能是造成雙脫氧測(cè)序法漏檢的原因。該研究表明，在檢測(cè)KRAS基因突變的過程中，樣本中腫瘤細(xì)胞所占比例是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素；焦磷酸測(cè)序技術(shù)比雙脫氧測(cè)序法更靈敏，可以同時(shí)進(jìn)行96個(gè)測(cè)序反應(yīng)，不必對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行特殊的純化處理，整個(gè)測(cè)序過程時(shí)間短，靈敏度可達(dá)5%。

黃新等［14］應(yīng)用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)116例Ⅳ期原發(fā)性和11例轉(zhuǎn)移性CRC病灶中KRAS基因第12和13號(hào)密碼子上的點(diǎn)突變，結(jié)果，116例Ⅳ期原發(fā)性CRC樣本中，有29例檢出KRAS基因點(diǎn)突變陽(yáng)性，突變率為25%，其中，24例（82.8%）為12號(hào)密碼子點(diǎn)突變，5例（17.2%）為13號(hào)密碼子點(diǎn)突變?？梢?，29例突變樣本第12號(hào)密碼子突變頻率高于第13號(hào)密碼子，且均為錯(cuò)義突變，與以往的報(bào)道一致［15］。此外，該研究中，116例Ⅳ期CRC KRAS基因突變頻率與文獻(xiàn)報(bào)道亞洲人CRC基因突變率（17%～28%）大致相同，且未發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期CRC的突變情況與早期CRC有明顯差異；11例轉(zhuǎn)移病灶中的KRAS基因狀態(tài)與其原發(fā)病灶高度一致，說明KRAS基因突變?cè)贑RC早期形成過程中便已發(fā)生，因此，在對(duì)轉(zhuǎn)移性CRC患者進(jìn)行KRAS基因檢測(cè)時(shí)，無論選擇原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行檢測(cè)，都是合理的，而患者KRAS基因的狀態(tài)可以指導(dǎo)對(duì)分子靶向藥物（如西妥昔單抗）的選擇。

王璇等［16］采用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)67例CRC患者石蠟包埋樣本的KRAS基因突變狀況，結(jié)果，檢測(cè)出26例（38.8%）KRAS基因突變樣本，其突變大多發(fā)生在第12號(hào)密碼子。該研究小組在分析突變類型和臨床參數(shù)之間的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，女性患者的KRAS基因突變率（57.7%）明顯高于男性患者（26.8%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其KRAS基因突變率（58.8%）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（32.0%）；而KRAS基因突變與患者的年齡、腫瘤所在部位、腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型和腫瘤分

期均無顯著相關(guān)性。提示，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以用于快速檢測(cè)KRAS基因突變，且KRAS基因突變?cè)谂訡RC患者和淋巴轉(zhuǎn)移的患者中更為多見。這些結(jié)論均可作為臨床上判斷CRC患者預(yù)后的重要參數(shù)。

de Macêdo等［17］研究了KRAS基因突變與CRC病人病理變化和臨床具體參數(shù)等信息的相關(guān)性，其間，通過偶聯(lián)巢式PCR優(yōu)化了焦磷酸測(cè)序法，用于檢測(cè)KRAS基因突變，無需重復(fù)提取DNA和PCR擴(kuò)增，成功率接近100%。該研究團(tuán)隊(duì)利用巢式PCR偶聯(lián)焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)421例未經(jīng)選擇的CRC患者的KRAS基因進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象均為石蠟包埋的組織。檢測(cè)結(jié)果顯示，421名患者中，KRAS基因突變率達(dá)33%，其中12號(hào)密碼子突變占76%，13號(hào)密碼子突變占24%。且該研究團(tuán)隊(duì)在比較KRAS基因突變與臨床參數(shù)之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織右側(cè)的突變大于且左側(cè)的突變，這與神經(jīng)侵襲相關(guān)?？梢姡瑢⒊彩絇CR和焦磷酸測(cè)序技術(shù)融合，可獲得高確定性檢測(cè)結(jié)果，能用于常規(guī)化驗(yàn)的輔助測(cè)試。

Kosmidou等［18］應(yīng)用焦磷酸測(cè)序法和Sanger測(cè)序法檢測(cè)171例CRC腺癌患者的KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一個(gè)腫瘤中，BRAF基因突變經(jīng)常與KRAS基因突變成負(fù)相關(guān)，說明這兩個(gè)基因在腫瘤的形成和發(fā)展中所起的作用是相互影響的。而且，焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果顯示，171例患者組織樣本中，92例（53.8%）的KRAS基因12或13號(hào)外顯子上有突變，并有2.3%的BARF基因突變及3.5%的PIK3CA基因突變；共檢測(cè)出的126個(gè)突變，其中57.9%是c.38G→A突變，22.2%是c.35G→T突變；50.7%的樣本存在腫瘤組織中心和外周的基因突變率不同的現(xiàn)象，且年齡、性別、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤的位置等差異也會(huì)導(dǎo)致突變頻率不同。此外，從檢測(cè)結(jié)果中能夠看出明顯的腫瘤異質(zhì)性，即同一腫瘤組織的不同位置基因突變率不同，這些都可能影響腫瘤分子診斷檢測(cè)和個(gè)體化治療的效果。并且，焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)出的突變樣本中有9個(gè)突變樣本Sanger測(cè)序法無法檢出，表明焦磷酸測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)KRAS基因突變時(shí)比Sanger測(cè)序技術(shù)更靈敏，能檢測(cè)到3%～5%的突變。

Dobre等［19］利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)250例CRC患者KRAS基因12、13、61號(hào)外顯子的突變情況，并隨機(jī)選擇100例患者用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果，焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)的250例患者中，KRAS基因突變率為46.4%，大部分突變發(fā)生在12號(hào)外顯子上，小部分在61號(hào)外顯子上；在對(duì)照組的100例樣本中，PCR-RFLP法檢測(cè)到48例突變，而焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到49例突變，且PCRRFLP法檢測(cè)到的突變均可以用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。該研究表明，這兩種檢測(cè)方法的靈敏度足以用于對(duì)CRC患者進(jìn)行分子診斷，以建立適當(dāng)?shù)闹委煼绞健６?，該研究小組建議，檢測(cè)大的腫瘤樣本時(shí)，使用PCR-RFLP法，因?yàn)檫@樣的樣本DNA濃度較高，且PCR-RFLP法相對(duì)便宜，而檢測(cè)小的腫瘤樣本組織（如穿刺樣本）時(shí)，應(yīng)選用焦磷酸測(cè)序法，因?yàn)檫@時(shí)癌細(xì)胞濃度小，此法較為靈敏。

Altimari等［20］比較了Sanger測(cè)序法、ARMSScorpion法、焦磷酸測(cè)序法和雜交芯片法檢測(cè)60例CRC樣本中KRAS基因12和13號(hào)密碼子突變的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性，結(jié)果，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，60例樣本中有20例KRAS基因?yàn)橐吧?；Sanger測(cè)序法、ARMSScorpion法、焦磷酸測(cè)序法和雜交芯片法的特異性均為100%，靈敏度分別為85%、90%、93%和92%，準(zhǔn)確度分別為90%、93%、95%和95%；Sanger測(cè)序法的局限性在于其分析靈敏度較低，低于其他3種方法。該研究團(tuán)隊(duì)還比較了目前經(jīng)常使用的幾種基因突變檢測(cè)方法，結(jié)果表明，在診斷CRC KRAS基因突變時(shí)，焦磷酸測(cè)序法是一個(gè)較為合適的方法。

2 基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的基因突變檢測(cè)在疾病診斷中的應(yīng)用研究

2.1 用于線粒體疾病診斷的基因突變檢測(cè)

人線粒體DNA是一個(gè)環(huán)狀DNA分子，用于編碼一些蛋白質(zhì)翻譯時(shí)所需的氧化磷酸酶。線粒體DNA 3243位A→G的突變可以導(dǎo)致母體遺傳性糖尿病和耳聾，即線粒體糖尿病，又稱母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征。然而，常用的Sanger測(cè)序法其靈敏度不足以檢測(cè)出這種突變。Yan等［21］應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)定量檢測(cè)無血緣的83名線粒體糖尿病患者白細(xì)胞線粒體DNA中A3243G突變，同時(shí)為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，用焦磷酸測(cè)序法、Sanger測(cè)序法和PCR-RFLP法分別對(duì)人工標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)比。結(jié)果表明，焦磷酸測(cè)

序法的檢測(cè)準(zhǔn)確性高于其他方法，靈敏度達(dá)2%，而A3243G突變有可能成為線粒體糖尿病的發(fā)病預(yù)測(cè)標(biāo)志。

線粒體轉(zhuǎn)移核糖核酸（mt-tRNA）突變是最常見的與人類疾病相關(guān)的線粒體突變的子類型（mtDNA）突變?；加卸嘞到y(tǒng)線粒體疾病的患者其特征是肌肉病變、脊髓運(yùn)動(dòng)失調(diào)、感音神經(jīng)性聽力損失、白內(nèi)障和認(rèn)知障礙等，通常存在m.7539C→T突變。Lehmann等［22］應(yīng)用焦磷酸測(cè)序法證實(shí)了mtDNA突變的異質(zhì)性。

2.2 用于甲狀腺癌診斷的基因突變檢測(cè)

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)是用于區(qū)分良性和惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的主要手段，然而約20%～40%的檢測(cè)結(jié)果是不確定的，需要輔助診斷測(cè)試來確認(rèn)其結(jié)果。而RAS基因突變已經(jīng)作為甲狀腺癌分型的標(biāo)志物。Guerra等［23］對(duì)37例甲狀腺疾病患者（16例良性增生性結(jié)節(jié)，21例甲狀腺濾泡癌）進(jìn)行NRAS和KRAS基因突變檢測(cè)，結(jié)果顯示，良性和惡性患者的RAS基因突變率分別為31%和62%，大多數(shù)樣本突變等位基因的比率小于50%。且該研究表明，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可作為區(qū)分良性與惡性甲狀腺腫瘤的輔助手段，對(duì)于臨床上甲狀腺癌的診斷和治療，可發(fā)揮重要作用。

在韓國(guó)，通過評(píng)價(jià)BRAF V600E突變，可以診斷乳頭狀甲狀腺癌癥?，F(xiàn)已有很多方法可用來檢測(cè)BRAF V600E突變，如直接測(cè)序法、等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（AS-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、焦磷酸測(cè)序技術(shù)等。直接測(cè)序法作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但是需要PCR，需要染料純化，靈敏度低；AS-PCR簡(jiǎn)單快速，但是需要電泳輔助，可能會(huì)導(dǎo)致污染，且電泳條帶很弱時(shí)很難讀取。Kang等［24］應(yīng)用PNA-clamping PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和焦磷酸測(cè)序技術(shù)等3種方法檢測(cè)100例乳頭狀甲狀腺癌癥患者石蠟包埋組織的BRAF V600E突變，并探討此突變對(duì)患者疾病診斷和預(yù)后的影響。結(jié)果，PNA-clamping PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和焦磷酸測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)陽(yáng)性率分別為66%、70%和68%，特異性分別是0.5%、1%和1%；且發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E突變與癌癥的進(jìn)程和不良預(yù)后因子相關(guān)，約30%具有此突變的患者其突變低于6%。該研究表明，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可與實(shí)時(shí)熒光PCR和PNA-clamping PCR一樣用于檢測(cè)BRAF V600F突變，并是一種可以快速、靈敏地檢測(cè)BRA V600E突變的方法，它的應(yīng)用對(duì)于臨床上乳頭狀甲狀腺癌癥的診斷和預(yù)后評(píng)估、進(jìn)而選用合適的治療方案具有重要意義。

2.3 用于白血病診斷的基因突變檢測(cè)

急性髓性白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）是由于髓系造血干細(xì)胞發(fā)生積累性的獲得性基因突變，進(jìn)而造成細(xì)胞增殖、分化和凋亡途徑發(fā)生改變的一種惡性疾病。NRAS基因突變是AML病例最常檢測(cè)出的髓系來源異常之一，其突變會(huì)產(chǎn)生一個(gè)具有穩(wěn)定活性的NRAS蛋白，此蛋白不受細(xì)胞增殖和凋亡的控制，目前已發(fā)現(xiàn)NRAS基因突變與AML有關(guān)。Jeong等［25］檢測(cè)分析了成人AML患者的NRAS基因突變，并將焦磷酸測(cè)序技術(shù)和直接測(cè)序法對(duì)NRAS基因突變的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，其間共檢測(cè)分析了來自于83名成人AML患者的90個(gè)骨髓樣本的NRAS基因12、13和61號(hào)密碼子突變情況。結(jié)果，突變檢出率達(dá)7.2%，并發(fā)現(xiàn)，具有NRAS基因突變的患者其血紅蛋白水平和FLT3突變發(fā)生率均明顯較高，其中，3例突變發(fā)生在12號(hào)外顯子，2例突變發(fā)生在13號(hào)外顯子，1例突變發(fā)生在61號(hào)外顯子，但所有突變?cè)谥委熎陂g都消失了；此外，用焦磷酸測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)后，再用直接測(cè)序法進(jìn)行確證，發(fā)現(xiàn)兩者數(shù)據(jù)基本一致。提示，NRAS基因突變和治療反應(yīng)、疾病進(jìn)程有明顯相關(guān)性，說明其在臨床上的重要性，而焦磷酸測(cè)序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因突變的簡(jiǎn)單、快速、高通量檢測(cè)，且無需電泳輔助，所提供的定量數(shù)據(jù)對(duì)于監(jiān)測(cè)與診斷病情發(fā)展及治療情況具有重要意義。

Gebauer等［26］應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)14位華氏巨球蛋白血癥患者和10位多發(fā)性骨髓瘤患者的MYD88基因突變情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，有78.6%（11/14）的華氏巨球蛋白血癥患者檢測(cè)出MYD88 p.L265P突變。為了驗(yàn)證此檢測(cè)結(jié)果，該研究團(tuán)隊(duì)用Sanger方法對(duì)照比較，結(jié)果表明，與其他方法相比，焦磷酸測(cè)序技術(shù)提供了一種快速、可靠、高靈敏、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的用于檢測(cè)福爾馬林固定或者石蠟包埋組織中MYD88 p.L265P突變的方法；且由于此技術(shù)可以量化等位基因，所以其還可有效用于后續(xù)的疾病診斷與監(jiān)測(cè)。

3 小結(jié)與展望

目前，基因突變檢測(cè)常采用的測(cè)序技術(shù)有Sanger測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等。Sanger

測(cè)序法廣泛應(yīng)用于人類基因領(lǐng)域的科研工作，并獲得了以精確完成人類基因組序列檢測(cè)為代表的諸多成果［27］。該法以DNA單鏈為模板，在DNA聚合酶的作用下，模板特異性引物根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將4種dNTP和經(jīng)不同顏色染料標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）加到引物的3’-羥基末端，并使引物鏈得到延伸或使其延伸過程終止，得到各種連續(xù)長(zhǎng)度的DNA片段；然后，經(jīng)過電泳分離，應(yīng)用激光誘發(fā)熒光法，可以檢測(cè)到各個(gè)片段末端的堿基種類。Sanger測(cè)序方法的優(yōu)點(diǎn)在于，作為目前的金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法，可以檢測(cè)幾乎所有的基因突變。但其缺點(diǎn)是定量性能差，在檢測(cè)個(gè)別基因突變時(shí)，靈敏度不佳，耗時(shí)長(zhǎng)，步驟多，費(fèi)用高，工作量較大，適合大規(guī)模測(cè)序而不適合測(cè)定單堿基差異。此外，Sanger測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音而很難檢測(cè)出來，因此，應(yīng)用于基因突變檢測(cè)時(shí)，其最低檢測(cè)靈敏度為10%左右，而檢測(cè)低于10%的突變時(shí)，其檢測(cè)誤差極大。高通量測(cè)序法的檢測(cè)靈敏度則可高達(dá)1‰，但其檢測(cè)成本高，用時(shí)長(zhǎng)，使其應(yīng)用受到限制。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一項(xiàng)高通量、低成本、自動(dòng)化程度高的測(cè)序技術(shù)，在檢測(cè)基因突變時(shí)，最低檢測(cè)靈敏度可達(dá)2%。此技術(shù)無須凝膠電泳輔助，無須對(duì)樣品進(jìn)行特殊的標(biāo)記和染色處理，省時(shí)省力，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀易懂，檢測(cè)過程耗時(shí)短，非常適用于對(duì)大量樣本的快速檢測(cè)。目前，焦磷酸測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為分析研究基因突變的重要手段，并廣泛應(yīng)用于臨床多種疾病的診斷和治療過程中，在檢測(cè)基因突變時(shí)，具有Sanger測(cè)序法和高通量測(cè)序法無法比擬的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)靈敏度高于Sanger測(cè)序法，比高通量測(cè)序法成本低、耗時(shí)短。而且，焦磷酸測(cè)序技術(shù)還廣泛應(yīng)用于遺傳分析學(xué)、SNP分型分析、分子診斷、細(xì)菌與病毒的分型分析、甲基化分析等。相信，隨著現(xiàn)代科技水平的不斷提高，焦磷酸測(cè)序技術(shù)也必將不斷進(jìn)步、完善，并受到越來越多的關(guān)注。

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［專家介紹］ 宋沁馨：副教授，博士生導(dǎo)師。江蘇省藥學(xué)會(huì)藥物基因組委員會(huì)委員，江蘇省青藍(lán)工程培養(yǎng)對(duì)象。新西蘭奧克蘭大學(xué)、新西蘭維多利亞大學(xué)、日本日立中央研究所訪問學(xué)者，科技部中新科學(xué)家交流計(jì)劃成員。主持國(guó)家及省自然基金、省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目、國(guó)家重大專項(xiàng)子課題等十余項(xiàng)。獲教育部科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、江蘇省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)、云南省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、南京市優(yōu)秀論文獎(jiǎng)等。發(fā)表論文50余篇，主編英文專著1部，副主編中文專著2部，參編著作9部。

Research Progress in Application of Gene Mutation Detection by Pyrosequencing Technique in Precision Medicine

LI Jingxuan1，2， JIN Yiru1，2， XU yinqiu1，2， SONG Qinxin1，2， ZHOU Guohua3
（1. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance of Ministry of Education， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，China； 2. Department of Pharmaceutical Analysis， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China； 3. Department of Pharmacology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command， Nanjing 210002， China）

Gene mutation detection has great significance in early diagnosis， individual medication guidance and monitoring of treatment response and drug resistance. With the continuous development of sequencing technology， DNA mutation detection has provided important

for individualized diagnosis and treatment of the diseases such as viral infections， blood diseases and solid tumors. Pyrosequencing is a real-time DNA sequencing technology based on pyrophosphate （PPi） detection by bioluminescent method without the need of electrophoresis and fluorescence labeling for DNA sequencing. It is characterized by high quantitative performance， accurate analysis and easy automation. Pyrosequencing provides a reliable method to detect gene mutation which is useful in disease diagnosis and treatment. The research progress in application of gene mutation detection by pyrosequencing technique in molecular targeting for individualized treatment and disease diagnosis was reviewed.

pyrosequencing； gene mutation； individualized treatment； disease diagnosis

Q523

A

1001-5094（2015）12-0889-07

接受日期：2015-11-04

項(xiàng)目資助：江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）項(xiàng)目（No. BK20151445）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（No. 2012M512179，2013T60962）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目（No. 2015ZD008）；藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（No. DQCP2015MS02）；國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目（No. J1030830）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；江蘇省青藍(lán)工程項(xiàng)目

*通訊作者：宋沁馨，副教授，博士生導(dǎo)師；

研究方向：藥物基因組學(xué)，臨床藥物分析，分子診斷新技術(shù)；

Tel：025-80860196；E-mail: songqinxin@cpu.edu.cn