煙堿污染對土壤細(xì)菌功能酶活性的影響

阮愛東，包天力，劉忱瀟，周笑腆

(1.河海大學(xué)水文水資源與水利工程科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210098;2.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，南京 210098)

煙堿 (nicotine)俗名尼古丁，是煙草類植物中最具生物活性的化學(xué)物質(zhì)，占其總量的95%，也是使用最為廣泛的生物堿［1］。煙堿易于透過包含血腦屏障在內(nèi)的大多數(shù)生物膜，進(jìn)入人體后可在肝臟中被轉(zhuǎn)化為多種代謝物［2～8］。煙堿在合成和發(fā)酵過程中，可被轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈致癌作用的亞硝胺(Nitrosamine)［9］。動物和人體攝入后還會促使血壓升高、脈搏加快、細(xì)胞膜自由脂肪酸增多和兒茶酚胺在血液中上升等［10～13］?？傊?，煙堿進(jìn)入環(huán)境后可對人體和動物產(chǎn)生多種多樣的毒害作用。

中國是煙草生產(chǎn)大國，與之相伴產(chǎn)生的煙草廢棄物每年約為1.0×106噸，其煙堿含量在0.50～7.87%(干重)［14］。另外，隨著啶蟲咪 (Acetamiprid)、吡蟲啉 (Imidacloprid)等以煙堿為有效成分的殺蟲劑的推廣使用，到2007年，已占世界殺蟲劑市場份額的20%［15］。由于煙堿易溶于水，存在于煙草廢棄物和煙堿型農(nóng)藥中的煙堿通過淋溶作用進(jìn)入土壤和地下水，改變土壤性狀、肥效及微生物群落結(jié)構(gòu)，所造成的環(huán)境污染問題不容忽視［16］。

土壤細(xì)菌功能酶的活性標(biāo)志著土壤的肥力狀況，及土壤中各類生化反應(yīng)的強(qiáng)度。而且，土壤細(xì)菌功能酶的活性與各類環(huán)境因素緊密相關(guān)，尤其在受到污染的情況下，土壤細(xì)菌功能酶的活性更可在一定程度上反映土壤微生物群體對環(huán)境污染物的響應(yīng)機(jī)制和對污染物的降解活性［17～19］。多數(shù)研究集中在煙堿污染對昆蟲的毒理學(xué)效應(yīng)，然而其對土壤細(xì)菌功能酶活性的相關(guān)研究成果尚鮮為報(bào)道。

本文以未受過煙堿和煙堿型農(nóng)藥污染的浙江大學(xué)華家池校區(qū)實(shí)驗(yàn)田土壤為材料，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的方法，系統(tǒng)地探究了不同濃度的外源煙堿污染對土壤細(xì)菌功能酶活性的影響及其動態(tài)變化分析，為全面評價(jià)煙堿污染后環(huán)境健康質(zhì)量和以土壤生物活性判斷煙堿污染程度的生物預(yù)警機(jī)制提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土樣取自浙江大學(xué)華家池校區(qū)實(shí)驗(yàn)田土壤，表層土 (深度0～20 cm)。采樣方式為多點(diǎn)采集，樣品采集后于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)避光、通風(fēng)處風(fēng)干，經(jīng)混勻、碾磨、過2 mm篩后備用。供試土壤的主要理化性質(zhì)如表1所示。

表1 供試土壤的主要理化性質(zhì)Tab.1 The main physical and chemical properties of the soil

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

試驗(yàn)在塑料桶 (頂口直徑179 mm，底面直徑134 mm，高161 mm)中進(jìn)行。每桶底部以1.0 kg的碎石 (直徑約10 mm)坡度填充，四層塑料紗布封墊，以兩根玻璃管 (直徑1.0 cm，長20 cm)于斜坡高處穿過紗布并與桶底連通。然后每桶裝土1.5 kg，經(jīng)玻璃管加水500 mL，逐步浸潤桶中土壤。預(yù)設(shè)溫度28℃下培養(yǎng)2周后，分別加入100 mL不同濃度的煙堿溶液，使桶中土壤所含煙堿濃度 分 別 為:0、 0.004、 0.008、 0.012、 0.016、0.020、0.030、0.040 μg/g 干土。充分混勻，分別在培養(yǎng)0、7、14、21、28、35和42 d時(shí)，采用五點(diǎn)法取樣供土壤細(xì)菌功能酶活性測定使用。以上8組各設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 土壤酶活性測定方法

試驗(yàn)過程中定期取土樣，測定其過氧化氫酶、蛋白酶、脲酶和磷酸酶。土壤過氧化氫酶測定采用滴定法;脲酶測定采用比色法;磷酸酶的測定采用磷酸苯二鈉比色法;蛋白酶測定采用比色法。具體參照土壤酶及其研究法［17］。每個(gè)土樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙堿污染對土壤過氧化氫酶活性的影響

煙堿污染對土壤過氧化氫酶活性的影響如圖1所示。由圖1可見，在煙堿污染第7 d，對照組和各處理組其土壤過氧化氫酶活性較初始時(shí)刻均呈現(xiàn)升高狀態(tài)，煙堿污染各處理組活性升高幅度均低于對照組土壤，這說明煙堿在添加初期延緩了土壤過氧化氫酶活性的升高波動趨勢，表現(xiàn)為一定的抑制作用。

圖1 煙堿對土壤過氧化氫酶活性的影響Fig.1 Effect of nicotine on the activity of catalase in the soil of vegetables fields

與對照組不同，各處理組 (除去煙堿污染濃度為0.004和 0.008 μg/g干土外)土壤過氧化氫酶活性的升高趨勢一直延續(xù)至煙堿污染后第14 d，而對照組土壤過氧化氫酶活性顯著性降低。第28 d和第35 d，各處理組土壤過氧化氫酶活性與對照組相比均表現(xiàn)為高于或顯著性高于 (p＜0.05)。由以上結(jié)果可見，煙堿污染對土壤過氧化氫酶活性表現(xiàn)為起初抑制，而后轉(zhuǎn)為刺激提高。這一變化可能與煙堿污染對土壤微生物區(qū)系的更迭及其豐度的變化等有一定關(guān)系。

煙堿污染第42 d時(shí)，對照組和各處理組土壤過氧化氫酶活性再次表現(xiàn)為升高狀態(tài)，但其升高幅度的顯著性 (p＜0.05)或極顯著性 (p＜0.01)低于對照組土壤。

2.2 煙堿污染對土壤蛋白酶活性的影響

煙堿污染對土壤蛋白酶活性的影響如圖2所示。煙堿污染7 d后，土壤蛋白酶的活性在各處理組顯著低于或極顯著低于對照組，經(jīng)t-檢驗(yàn)，煙堿污染濃度為 0.012和0.016 μg/g干土處理的土壤蛋白酶活性顯著性低于對照組 (p＜0.05)，而煙堿污染濃度分別為 0.02、0.03 和 0.04 μg/g 干土處理的土壤蛋白酶活性與對照組相比存在極顯著性差異 (p＜0.01)。

而在第14 d，各處理組土壤酶活性均無顯著性差異，到第 21 d，除了 0.004 和 0.008 μg/g干土處理的土壤蛋白酶活性低于對照組，其余各處理組的土壤蛋白酶活性均得到激發(fā)，其中0.012和0.016 μg/g干土處理組的土壤蛋白酶活性顯著性高于對照組 (p ＜ 0.05)，而 0.02、0.03 和 0.04 μg/g干土處理的土壤蛋白酶活性與對照組相比存在極顯著性差異 (p＜0.01)。

由圖2可知，染毒后第21 d～42 d，土壤蛋白酶活性在對照組中基本沒有波動，而處理組中其活性的波動具有較大的變化，因此推測其活性變化與煙堿污染有一定關(guān)系。例如在28 d時(shí)，土壤蛋白酶活性除在 0.012、0.02 μg/g干土處理組接近或略低于對照組外，其余處理組均顯著性高于對照組土壤 (p＜0.05);而在35 d 時(shí)，除 0.016 μg/g 干土處理組，其余各處理組均低于對照組;此外，在42 d時(shí)，0.016 μg/g干土處理組與對照組接近，0.040 μg/g干土處理組顯著性低于對照土壤 (p＜0.05)，而其余各處理組土壤蛋白酶活性均顯著性高于對照土壤 (p＜0.05)。土壤蛋白酶參與調(diào)解生物的氮素代謝，且與土壤氮素循環(huán)有關(guān)［20］，煙堿污染在土壤中的降解也可看成是一類氮素循環(huán)的過程，因此土壤蛋白酶在煙堿污染后期所表現(xiàn)出的受激發(fā)與波動特性，都可能與煙堿在土壤中被微生物所降解的過程有關(guān)。

圖2 尼古丁對菜地土壤蛋白酶活性的影響Fig.2 Effect of nicotine on the activity of the proteinase in the soil of vegetables fields

2.3 煙堿污染對土壤脲酶活性的影響

煙堿污染對土壤脲酶活性的影響如圖3所示。對照組土壤脲酶活性隨時(shí)間推移逐漸降低并趨于平穩(wěn)，但煙堿污染的各處理組其土壤脲酶活性與對照組之間存在差異。染毒后7 d時(shí)，較低濃度處理組(煙堿濃度為 0.004、0.008 和 0.012 μg/g 干土)土壤脲酶活性受到激發(fā)，顯著高于對照土壤，經(jīng)t-檢驗(yàn)p＜0.05。且隨著濃度的降低，脲酶活性呈升高趨勢，在0.004 μg/g干土處理組土壤脲酶活性極顯著性高于對照組 (p＜0.01)。較高濃度處理組 (煙堿濃度為 0.016、0.020、0.030 和 0.040 μg/g干土)土壤脲酶活性表現(xiàn)為抑制，且除0.020 μg/g 干土處理組略高于 0.016 μg/g 干土處理外，隨著煙堿污染濃度的升高，土壤脲酶活性顯著降低，其中0.030和0.040 μg/g干土處理組土壤脲酶活性極顯著低于對照土壤 (p＜0.01)。

隨著染毒培養(yǎng)時(shí)間的延長，土壤脲酶活性除煙堿污染濃度為0.040 μg/g干土處理組幾乎始終低于對照組 (21 d時(shí)略高于對照組)，表現(xiàn)為抑制，其余各處理組土壤脲酶活性顯著高于對照組，表現(xiàn)為刺激。但通過回歸分析，發(fā)現(xiàn)污染濃度與土壤脲酶活性之間的劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯，R2均小于0.5。由此可以推測，土壤生態(tài)系統(tǒng)非常復(fù)雜，多種因素可共同作用與影響土壤中脲酶的活性，因而煙堿污染濃度與土壤脲酶活性之間無明顯線性關(guān)系。

圖3 尼古丁對菜地土壤脲酶活性的影響Fig.3 Effect of nicotine on the activity of the urease in the soil of vegetables fields

2.4 煙堿污染對土壤磷酸酶活性的影響

煙堿污染對土壤磷酸酶活性的影響如圖4所示。由圖4可知，土壤磷酸酶活性在恒溫培養(yǎng)7 d時(shí)有所上升，而后呈現(xiàn)下降趨勢，但各處理組與對照組之間存在顯著差異。土壤磷酸酶活性除污染濃度為0.040 μg/g干土處理組表現(xiàn)為抑制外，其余各處理組酶活均表現(xiàn)為刺激，且均高于同期對照組，其中污染濃度為 0.015、0.020 和 0.030 μg/g干土處理組土壤磷酸酶活性與對照組差異較顯著(p＜0.05)。

在第14 d和第21 d時(shí)，各處理組土壤磷酸酶活性均呈現(xiàn)降低趨勢。在第14 d各處理組土壤磷酸酶活仍均高于對照組，到第21 d時(shí)卻表現(xiàn)為顯著或極顯著性低于對照組。土壤pH值對土壤磷酸酶活性影響顯著，土壤磷酸酶根據(jù)其對不同pH的適應(yīng)情況可分為酸性磷酸酶、中性磷酸酶與堿性磷酸酶。有研究證明低酸度對中性磷酸酶產(chǎn)生一定的先促進(jìn)后抑制效應(yīng)［21］。根據(jù)煙堿污染后土壤磷酸酶活性先刺激后抑制的狀態(tài)，可以推測這一變化與土壤在煙堿降解中pH由初始的中性而后發(fā)生改變有關(guān)。從第28 d后各處理組土壤磷酸酶活性表現(xiàn)為趨于一致。

圖4 尼古丁對菜地土壤磷酸酶活性的影響Fig.4 Effect of nicotine on the activity of the phosphatase in the soil of vegetable fields

3 結(jié)論

3.1 土壤過氧化氫酶活性在煙堿污染條件下與自然條件下 (對照組土壤)的影響相對比，呈現(xiàn)出一定的波動勢態(tài)。開始表現(xiàn)為抑制作用，而后為促進(jìn)作用，在抑制、促進(jìn)作用想交替的過程中，煙堿污染處理組土壤過氧化氫酶活性的變化與自然條件對照組始終存在一定的差異。

3.2 煙堿污染影響菜地土壤蛋白酶活性。短期內(nèi)(7 d)抑制土壤蛋白酶活性，但隨著時(shí)間的延長(21 d)較高濃度的煙堿 (0.012～0.040 μg/g 干土)可促進(jìn)土壤蛋白酶活性，煙堿濃度越高，酶活性促進(jìn)的幅度越大。

3.3 短期內(nèi)，較低濃度的煙堿污染處理組 (濃度低于或等于0.012 μg/g干土)，土壤脲酶活性的得到促進(jìn)，且煙堿濃度越低，酶活性促進(jìn)的幅度越大;而較高濃度煙堿 (0.016～0.040 μg/g干土)則表現(xiàn)為對土壤脲酶活性的抑制。恒溫培養(yǎng)到28～35 d，除了煙堿污染濃度為 0.030 和 0.040 μg/g干土的處理組外，其余各處理組土壤脲酶活性均得到刺激，而后趨于一致。

3.4 煙堿污染對土壤磷酸酶活性，開始表現(xiàn)先刺激后抑制的狀態(tài)，在第7 d和第14 d，各處理組土壤磷酸酶活性大都高于對照組，在第21 d時(shí)轉(zhuǎn)為抑制，28 d后，各處理組土壤磷酸酶活性與對照組趨于一致。

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