羥基苯甲腈類抑制劑與Cdc25B磷酸酯酶相互作用的結(jié)合位點(diǎn)殘基觀察

王喆，趙宏濤

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211）

Cdc25磷酸酯酶屬于雙特異性蛋白磷酸酶，在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，可將細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）去磷酸化，從而使其激活［1］。Cdc25磷酸酯酶包括Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C三種亞型［2］，其中Cdc25B可以與CDK2/Cyclin A復(fù)合物結(jié)合，水解CDK2中ATP結(jié)合位點(diǎn)loop上兩殘基的磷酸根，進(jìn)而將其激活［3］。Cdc25B在多種腫瘤細(xì)胞如結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌等過度表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展起促進(jìn)作用，下調(diào)Cdc25B表達(dá)會(huì)引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此，Cdc25B已經(jīng)成為治療癌癥的潛在藥物作用靶點(diǎn)［4，5］。傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)思路是針對(duì)Cdc25B的催化活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)抑制劑，但該位點(diǎn)空間體積較小，導(dǎo)致小分子抑制劑設(shè)計(jì)難度增加。最近研究［6］報(bào)道了新型羥基苯甲腈類Cdc25B抑制劑，此類抑制劑并不與Cdc25B催化活性位點(diǎn)結(jié)合，而是作用于Cdc25B與CDK2/Cyclin A復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制Cdc25B酶活性。目前對(duì)Cdc25B中專門負(fù)責(zé)識(shí)別羥基苯甲腈類抑制劑殘基的認(rèn)識(shí)還十分有限，本研究利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法確定了羥基苯甲腈類抑制劑與Cdc25B磷酸酯酶相互作用的結(jié)合位點(diǎn)殘基。

1 材料與方法

1.1 Cdc25B蛋白及其結(jié)構(gòu)預(yù)處理 從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫下載人Cdc25B/A8H（PDB編號(hào):4WH7）和Cdc25B/3M8（PDB編號(hào):4WH9）復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，去除晶體結(jié)構(gòu)中的硫酸根離子和甘油分子，只保留小分子抑制劑周圍0.4 nm范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)水分子。

1.2 A8H、3M8與Cdc25B磷酸酯酶相互作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬參數(shù)設(shè)置 分子動(dòng)力學(xué)模擬所用軟件為 Gromacs 4.5.5，蛋白采用 Amber FF99SB 力場［7］，小分子抑制劑采用GAFF（General Amber Force Field）［8］，通過量子化學(xué)半經(jīng)驗(yàn)AM1方法對(duì)小分子抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并利用AM1-BCC方法擬合出小分子抑制劑原子的局部電荷。在進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬前，先將兩個(gè)蛋白/抑制劑復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)置于TIP3P水盒子中，水盒子邊緣到最近的溶質(zhì)原子的距離為1.0 nm。此外，模擬使用周期邊界條件，利用PME（Particle Mesh Ewald）方法校正長程靜電作用，使用LINCS算法限制連有氫原子化學(xué)鍵的鍵長，分子動(dòng)力學(xué)模擬所用范德華作用閾值為1.0 nm，模擬溫度設(shè)定為300 K，恒溫模擬算法為Velocity Rescaling［9］。分子動(dòng)力學(xué)模擬積分步長為1.0 fs，每隔10 ps保存1次軌跡。在進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)平衡前，對(duì)兩個(gè)蛋白/抑制劑復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行最速下降法優(yōu)化，直到體系原子所受力最大值不超過1 000 kJ/（mol·nm2）。為平衡溶劑水分子，在恒溫恒容條件下，給兩個(gè)蛋白/抑制劑復(fù)合物重原子加1 000 kJ/（mol·nm2）的限制力進(jìn)行100 ps分子動(dòng)力學(xué)模擬。然后去掉該限制力，在恒溫恒容條件下進(jìn)行1 ns分子動(dòng)力學(xué)平衡過程以及10 ns正式分子動(dòng)力學(xué)模擬。

1.3 Cdc25B/羥基苯甲腈類抑制劑復(fù)合物的穩(wěn)定性觀察 為研究Cdc25B/抑制劑復(fù)合物在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中的穩(wěn)定性，本研究以10 ns正式分子動(dòng)力學(xué)模擬的起始結(jié)構(gòu)為參照，計(jì)算了Cdc25B/A8H和Cdc25B/3M8復(fù)合物蛋白骨架Cα原子均方根偏差（RMSD）隨時(shí)間變化的曲線。各體系RMSD數(shù)值在5 ns后基本在0.15～0.2 nm范圍內(nèi)波動(dòng)，上述各體系在5 ns后達(dá)到分子動(dòng)力學(xué)模擬的平衡狀態(tài)，分子動(dòng)力學(xué)模擬產(chǎn)生的后5 ns軌跡可以用于進(jìn)一步的氫鍵作用和相互作用能分析。

1.5 A8H、3M8與CDC25B結(jié)合位點(diǎn)殘基相互作用能計(jì)算方法 根據(jù)Amber力場計(jì)算公式［12］，計(jì)算小分子抑制劑（A8H和3M8）與CDC25B活性位點(diǎn)殘基的靜電相互作用能和范德華相互作用能，A8H、3M8與殘基之間的總相互作用能為靜電相互作用能和范德華相互作用能之和，相互作用能計(jì)算所使用的軌跡與氫鍵作用分析相同。

2 結(jié)果

2.1 A8H、3M8與Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基的氫鍵作用 A8H與Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)各殘基Y382、D397、K399、R485、R488、R492 形成氫鍵的概率分別為 0、2.00%、0.40%、0.60%、0、0，3M8 與 Cdc25B 結(jié)合位點(diǎn)各殘基 Y382、D397、K399、R485、R488、R492 形成氫鍵的概率分別為 11.38%、12.97%、0.80%、4.19%、94.41%、97.21%。3M8 的磺酸根可以與R488、R492側(cè)鏈的胍基以及Y382側(cè)鏈的酚羥基形成氫鍵作用，3M8的酚羥基與D397側(cè)鏈的羧基形成氫鍵作用，其中3M8與Y382、D397之間的氫鍵作用是不能從晶體結(jié)構(gòu)看到的。

2.2 A8H、3M8與Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基的相互作用能 D397、L398、C484、R485、R488、M505 與 A8H形成了較強(qiáng)相互作用，Y382、D397、L398、C484、R485、R488、R492、M505 與 A8H 形成了較強(qiáng)相互作用，詳見圖1。

3 討論

圖1 A8H、3M8與Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基相互作用能

確定生物大分子中參與配體分子識(shí)別的殘基，是進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。雖然Lund等［6］通過X射線晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了Cdc25B中對(duì)R488和R492的識(shí)別作用，但是Cdc25B對(duì)抑制劑的識(shí)別是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，其他一些極性殘基也在這兩個(gè)殘基附近，在動(dòng)態(tài)的分子識(shí)別過程中，它們也可能與小分子抑制劑形成強(qiáng)極性相互作用，從而參與該類抑制劑的識(shí)別。除了極性作用，非極性作用也是分子識(shí)別的關(guān)鍵。由于羥基苯甲腈類抑制劑具有像苯環(huán)這樣的芳香基團(tuán)，推測Cdc25B中某些疏水殘基在該類抑制劑的識(shí)別過程中同樣發(fā)揮重要作用。單純觀察蛋白/抑制劑復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，很難發(fā)現(xiàn)哪些疏水殘基參與了抑制劑的識(shí)別。相比靜態(tài)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，分子動(dòng)力學(xué)方法可以通過計(jì)算，模擬出Cdc25B與羥基苯甲腈類抑制劑之間的動(dòng)態(tài)相互作用情況，并在此基礎(chǔ)上，通過分析氫鍵作用概率和相互作用能，確定參與抑制劑識(shí)別的殘基。

氫鍵作用是蛋白對(duì)小分子進(jìn)行識(shí)別的主要方式之一，在氫鍵作用分析中，本研究計(jì)算了小分子抑制劑與Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基氫鍵作用概率，那些與A8H或3M8形成穩(wěn)定氫鍵作用的殘基被認(rèn)為參與了Cdc25B對(duì)此類小分子抑制劑的生物識(shí)別。本研究結(jié)果表明，Y382、D397、R488和R492可以通過氫鍵作用方式，幫助Cdc25B識(shí)別羥基苯甲腈類小分子抑制劑。由于氫鍵作用分析只是在一定程度反映了小分子抑制劑與Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基之間靜電作用強(qiáng)度的差異，不能反映非極性的范德華相互作用大小。為進(jìn)一步研究Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基對(duì)該類小分子抑制劑的識(shí)別機(jī)制，就需要了解Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基與這兩個(gè)小分子抑制劑之間的相互作用強(qiáng)度?？紤]到這兩個(gè)抑制劑都占據(jù)了Cdc25B相同的區(qū)域，兩個(gè)小分子抑制劑A8H和3M8與這些殘基的相互作用強(qiáng)度無法通過分析晶體結(jié)構(gòu)來判斷。為進(jìn)一步研究Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基與小分子抑制劑的相互作用，就必須計(jì)算Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)殘基與這兩種小分子抑制劑的相互作用能。本研究結(jié)果表明，Y382、D397、L398、C484、R485、R488、R492、M505參與了Cdc25B對(duì)羥基苯甲腈類抑制劑的識(shí)別作用。

綜上，本研究利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，通過分析Cdc25B與羥基苯甲腈類抑制劑之間氫鍵作用概率和相互作用能，發(fā)現(xiàn) R488和 R492參與了Cdc25B對(duì)羥基苯甲腈類抑制劑的識(shí)別，這與既往研究［6］結(jié)果相吻合。在此基礎(chǔ)上，本研究還發(fā)現(xiàn)Y382、D397、L398、C484、R485 和 M505 同樣參與了Cdc25B對(duì)羥基苯甲腈類抑制劑的識(shí)別。因此，研究人員在設(shè)計(jì)Cdc25B抑制劑時(shí)，需要注意調(diào)控小分子化合物與這些殘基之間的相互作用。

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