不同中醫(yī)證型尖銳濕疣患者外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA表達變化及意義

楊永茂，賈梅，楊桂蘭，沈敏娟，高雯

（1內(nèi)蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000;2蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院;3吳江市第一人民醫(yī)院）

尖銳濕疣（CA）是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的外生殖器黏膜部位的增生性病變。大量研究［1］證明，CA的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸與機體的免疫狀態(tài)關(guān)系密切。2006年6月～2008年7月，我們觀察了不同中醫(yī)證型CA外周血及疣體組織中Toll樣受體3（TLR3）、Toll樣受體7（TLR7）mRNA變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院收治的CA患者 30例，男 19例，女 11例;年齡 20～50（32.40±5.62）歲;病程 3 ～6（3.89 ±1.25）個月。納入標準:CA臨床診斷明確（疣體典型，呈菜花樣、乳頭樣或雞冠樣），疣體≥黃豆大，1個或多個，醋酸白試驗陽性，年齡18～60歲，無其他系統(tǒng)性疾病或急慢性皮膚病，病史3個月以上，3周內(nèi)未用其他治療CA的內(nèi)服及外用藥物，女性患者排除懷孕、哺乳及月經(jīng)期。中醫(yī)通過辯證論治分為Ⅰ型濕熱蘊結(jié)型（病程較短，表面潮紅，糜爛，滲液，伴心煩，口苦，小便黃，大便干結(jié)或不暢，舌質(zhì)紅，苔黃膩，脈滑數(shù)）16例和Ⅱ型正虛邪戀型（病程較長，病情屢治屢發(fā)，久治不愈，伴神疲乏力，納呆，舌體胖淡，脈象沉細）14例。對符合上述入選標準者詳細記錄病史資料，行血常規(guī)檢查，然后自肘靜脈抽取血5 mL，加入肝素抗凝管1管（3 mL分離單個核細胞）;之后按常規(guī)切取100 mg的疣體組織，迅速置液氮中冷凍后轉(zhuǎn)存至-70℃冰箱保存。另選30例作為對照（C組，男性來自泌尿外科包皮環(huán)切患者，女性為美容手術(shù)者）。

1.2 外周血及疣體組織TLR3、TLR7 mRNA檢測在液氮中將疣體組織研磨呈細末狀，淋巴細胞分離液分離外周血單一核細胞。采用TRIzol試劑，按說明書操作提取總RNA。按試劑說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，-70℃保存?zhèn)溆?。目的片段引?TLR3:5＇-GGACTTTGAGGCGGGTGTT-3＇，5＇-TGTTGAACTGCATGATGTACCTTGA-3＇，141 bp;TLR7:5＇-TCTTCAACCAGACCTCTACATTCCA-3＇，5＇-GGAACATCCAGAGTGACATCACAG-3＇，172 bp;β-肌動蛋白:5＇-CCGCCATGTAGGTCGCTAT-3＇，5＇-TGACACGCCATCACCAG-3＇。標準品選用正常對cDNA梯度稀釋后獲得（將cDNA的梯度換算為拷貝數(shù)，進行倍比稀釋，即取10 μL cDNA加入90 μL雙蒸水，混勻，依次類推，共稀釋4個梯度）。實時熒光定量PCR檢測:25 μL反應(yīng)體系中含有上下游各1 μL（20 pmol/L），熒光染料0.5 μL（20 pmol/L），Taq 酶 0.3 μL（5 U），dNTPs 1 μL及cDNA 1 μL（20 pmol/L）。程序為95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸1 min，用含有4個梯度濃度的cDNA制備成標準曲線對標本進行定量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA比較見表1。

表1 各組外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA比較（ ±s）

表1 各組外周血及疣體組織中TLR3、TLR7 mRNA比較（ ±s）

注:與 C 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，△P ＜0.05。

TLR3 mRNA TLR7 mRNA組別 外周血 疣體組織A 組 2.85 ±0.23＊△ 3.06 ±0.21＊△ 2.49 ±0.13＊△ 2.71 ±0.14外周血 疣體組織＊△B 組 2.77 ±0.16* 2.96 ±0.19* 2.37 ±0.15* 2.74 ±0.16*C組1.45 ±0.31 1.78 ±1.19 1.50 ±0.29 1.87 ±1.43

3 討論

CA屬于中醫(yī)“臊瘊”的范疇，氣血不和，腠理不密，外邪侵襲，房事不潔，感受穢濁，邪毒與氣血相搏，凝聚肌膚而成。如果未及時治療或治療不當，濕邪蘊久困脾，脾虛濕濁下注，釀濕生熱，濕熱交結(jié)，而致正氣虧虛，不能驅(qū)邪外出，導(dǎo)致病程纏綿遷延，反復(fù)發(fā)作而又難以治愈。因此，將CA分為濕熱蘊結(jié)型和正虛邪戀型來研究，符合 CA的發(fā)病機理［2，3］。CA患者感染HPV后宿主與病毒之間的相互較量最終決定病情的發(fā)展，TLR受體在免疫方面起重要作用，在CA患者存在TLR3和TLR7的高表達現(xiàn)象，通過與健康者比較，CA患者顯著偏高，濕熱型較正虛邪戀偏高，提示中醫(yī)不同證型之間在微觀方面有不同的變化，符合中醫(yī)的辯證分型。

TLR受體是近年來發(fā)現(xiàn)的重要天然識別受體［4，5］，是一類重要的模式識別受體，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，在人類已發(fā)現(xiàn)至少12個家族成員，廣泛分布在單核細胞、T細胞、血管內(nèi)皮細胞、消化道上皮細胞、脂肪細胞、心肌細胞等細胞表面，與病毒識別有關(guān)的有 TLR3、TLR7、TLR8、TLR9，當病原微生物入侵時，機體通過識別外源性微生物的侵入，并激活免疫反應(yīng)清除外來微生物［6～9］。TLR是迄今認識的第一組機體通過感知病原體直接作出防御反應(yīng)的天然免疫受體，在先天性免疫激活及其與獲得性免疫之間的信號傳導(dǎo)中起重要作用，尤其在識別微生物時起關(guān)鍵作用，如TLR3能夠識別雙鏈RNA病毒，TLR7能識別單鏈RNA病毒［10］。機體的免疫反應(yīng)包括兩種機制，一種是由巨噬細胞和樹突細胞（DC）承擔的先天性免疫，另一種是由T、B細胞承擔的獲得性免疫。在病毒感染中，先天性免疫發(fā)揮著極其重要的防御作用。TLR能直接活化抗微生物應(yīng)急防御系統(tǒng)，合成和分泌Ⅰ型干擾素，而Ⅰ型干擾素是目前抗病毒治療的主要措施［7，11］。抗病毒藥鳥苷類似物及免疫調(diào)節(jié)劑就是能通過TLR7激活DC，誘導(dǎo)不同的炎癥性誘導(dǎo)因子產(chǎn)生，在臨床上用來治療包括CA在內(nèi)的多種病毒性皮膚病。治療CA的常用藥物咪喹莫特就是通過TLR7介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的生成，連接先天免疫和適應(yīng)性免疫，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)［12，13］。

本研究顯示，CA患者外周血及組織中TLR3、TLR7 mRNA均高于健康對照者，且濕熱蘊結(jié)型高于正虛邪戀型，提示CA患者與健康人群比較，Toll受體積極參與人體免疫系統(tǒng)清除病毒;不同證型之間比較更進一步說明整體觀的重要性，用微觀的理論佐證宏觀的辯證論治，也為CA中醫(yī)辨證分型的客觀化、微觀化提供了理論依據(jù)，為CA發(fā)病機理方面提供了參考資料。

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