同型半胱氨酸對大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移能力的影響及其可能機制

鮑曉梅，鄭宏超

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海200031)

目前認為，動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮細胞損傷和血管平滑肌細胞(SMCs)增殖和遷移有關(guān)。我們既往研究證實，Hcy可通過p38MAPK(分裂原激活的蛋白激酶)途徑激活NADPH氧化酶，增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生，誘導內(nèi)皮細胞凋亡，促進動脈粥樣硬化形成［1，2］。有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy引起的氧化應激反應不僅不能誘導SMCs凋亡，反而會促進其增殖和遷移［3～6］，但其具體作用機制尚不明確。2014年10～12月，我們觀察了Hcy對大鼠血管SMCs增殖和遷移的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量(281±22)g，購自中國科學院上海生命科學研究院動物中心［許可證號:SCXK(滬)2012-0002］。Hcy、p38 MAPK抑制劑SB203580、四唑鹽(MTT)、NADPH氧化酶抑制劑(DPI)及光澤精，美國Sigma公司;乙酰乙酸二氯熒光黃(DFC-DA)、N-乙酞半胱氨酸(NAC)，德國 Calbiochem公司;DMEM 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、FBS，美國 GIBCO公司。FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司;Berthold LB960化學發(fā)光檢測儀，德國伯托公司。

1.2 大鼠血管SMCs分離、培養(yǎng) 常規(guī)處死SD大鼠，剖胸取出胸主動脈。分離血管周圍組織，縱向剖開血管，分離中膜。將中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，置入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)9～10天。當細胞融合達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 Hcy最佳濃度確定 取傳3～6代的SMCs接種于96 孔板，分別予 0、50、100、200 μmol/L Hcy 處理24 h，檢測不同濃度Hcy對細胞增殖、遷移、活性氧、NADPH氧化酶活性的影響(方法見1.4)，以對上述指標影響最明顯的濃度為最佳濃度。結(jié)果見表1。由表1可見，Hcy呈劑量依賴性誘導SMCs增殖和遷移及ROS產(chǎn)生，激活NADPH氧化酶。本研究確定200 μmol/L為 Hcy最佳濃度，并用于以下研究。

1.4 細胞干預及相關(guān)指標觀察

1.4.1 細胞增殖能力 采用MTT比色法。將培養(yǎng)細胞隨機分為五組，對照組不處理;Hcy組加入200 μmol/L的 Hcy;NAC+Hcy組、DPI+Hcy組、SB203580+Hcy組先分別加入1mmol/L的NAC、10 μmom/L 的 DPI、10 μmol/L 的 SB203580 干預0.5 h，再分別加入 200 μmol/L 的 Hcy;各組均干預24 h。分別加入5 g/L MTT 10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入二甲亞砜100 μL/孔，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解后，用酶標儀檢測各孔570 nm處光密度值(OD值)。

表1 不同濃度Hcy對SMCs增殖、遷移能力及ROS生成、NADPH氧化酶活性的影響(±s)

表1 不同濃度Hcy對SMCs增殖、遷移能力及ROS生成、NADPH氧化酶活性的影響(±s)

注:與0 μmol/L 比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

Hcy濃度 增殖能力 遷移能力 ROS生成NADPH mol/L 0.72 ±0.05 - - -50 μmol/L 0.78 ±0.04 1.33 ±0.19 1.63 ±0.27* 1.59 ±0.15*100 μmol/L 0.84 ±0.05* 2.29 ±0.17＊＊2.46 ±0.23＊＊ 2.33 ±0.18＊＊200 μmol/L 0.93 ±0.06＊＊ 3.57 ±0.24＊＊3.22 ±0.26＊＊ 3.01 ±0.21＊＊P氧化酶活性0 μ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

1.4.2 細胞遷移能力 采用Transwell小室法。細胞按1.4.1分組及處理。孵育24 h后，從37℃孵箱中取出Transwell，將上室取出，用棉簽輕輕搽拭上室內(nèi)側(cè)壁，磷酸鹽緩沖液清洗，冰乙醇固定，蘇木素、伊紅染色，顯微鏡下細胞計數(shù)，隨機選取5個視野(200倍)，取其平均數(shù)。將對照組的遷移能力設(shè)為1，其他各組細胞遷移能力為與對照組的比值。

1.4.3 細胞內(nèi)ROS 采用熒光探針H2DCF-DA法。細胞按1.4.1分組及處理。孵育24 h后，冰PBS洗3次，加入10 μmol/L H2DCF-DA 避光反應30 min，PBS洗3次。0.25%胰酶消化后，流式細胞儀觀察各組平均熒光強度。將對照組的熒光值定為1，其他各組細胞的熒光值為與對照組的比值。

1.4.4 NADPH氧化酶活性 采用光澤精化學發(fā)光法。細胞按1.4.1分組及處理。孵育24 h后加入含蛋白酶抑制劑的冰緩沖液，裂解細胞。以Bradford方法檢測蛋白濃度(調(diào)整濃度至1 mg/mL)。取100 μL 樣品，加入光澤精(5 μmol/L)、NADPH(100 μmol/L)，于化學發(fā)光計數(shù)器上計數(shù)。將對照組的NADPH氧化酶活性設(shè)為1，其他各組NADPH氧化酶活性為與對照組的比值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

NAC+Hcy組、DPI+Hcy組、SB203580+Hcy組細胞增殖及遷移能力、ROS生成、NADPH氧化酶活性均低于 Hcy組(P ＜0.05或 ＜0.01)，見表2。

3 討論

高同型半胱氨酸血癥是心血管疾病的獨立危險因素，Hcy可損傷血管內(nèi)皮細胞，促進血管壁細胞合成分泌黏附分子和趨化因子，誘導中膜SMCs向內(nèi)膜下遷移和增殖，是動脈硬化的始動環(huán)節(jié)［4］。Hcy在血漿中可以自身氧化或通過二硫鍵硫化，生成同型胱氨酸和同型半胱氨酸硫內(nèi)酯，同時激活黃嘌呤氧化酶等氧化酶系統(tǒng)，誘導血管壁細胞產(chǎn)生超氧化物陰離子等ROS并抑制谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性，最終誘導氧化應激損傷，動脈粥樣硬化形成［6］。研究發(fā)現(xiàn)，ROS作為第二信使參與細胞信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮祖細胞的增殖和凋亡［1，2］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度 Hcy呈劑量依賴性誘導SMCs增殖、遷移，并伴隨細胞內(nèi)ROS水平進行性升高，給予氧自由基清除劑NAC和NADPH氧化酶抑制劑DPI預處理，在減少ROS生成的同時可明顯抑制SMCs增殖和遷移，提示Hcy誘導SMCs增殖、遷移作用也有氧化應激機制參與。

表2 各組SMCs增殖、遷移能力及NOS生成、NADPH氧化酶活性比較(±s)

表2 各組SMCs增殖、遷移能力及NOS生成、NADPH氧化酶活性比較(±s)

注:與 Hcy組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01。

組別 增殖能力 遷移能力 ROS NADPH氧化酶活性對照組0.72 ±0.05 - - -Hcy 組 0.93 ±0.06 3.57 ±0.24 3.22 ±0.26 3.01 ±0.21 NAC+Hcy組 0.84 ±0.08* 2.03 ±0.17△ 1.37 ±0.31△ 2.61 ±0.18*DPI+Hcy組 0.79 ±0.04△ 2.25 ±0.21△ 1.25 ±0.25△ 1.16 ±0.12△SB203580+Hcy組 0.83 ±0.07*2.17 ±0.18△ 2.11 ±0.18△ 2.02 ±0.15△

作為血管壁ROS的主要來源，NADPH氧化酶的活性受許多外源性或內(nèi)源性刺激因子的調(diào)節(jié)。NADPH氧化酶來源的ROS參與了堿性成纖維細胞生長因子、血管緊張素Ⅱ、IL-18和單核細胞趨化蛋白-1誘導的 SMCs遷移［7～11］。有研究發(fā)現(xiàn)，采用siRNA技術(shù)干擾Nox1基因表達的SMCs，經(jīng)堿性成纖維細胞生長因子誘導產(chǎn)生的活性氧水平明顯降低，遷移活性明顯下降，轉(zhuǎn)染Nox1后SMCs的遷移活性可恢復正常。進一步研究發(fā)現(xiàn)，來源于Nox1 y/-小鼠的SMCs細胞遷移能力較來源于Nox1 y/+小鼠的SMCs細胞遷移能力明顯下降［7］。上述研究均證實，NADPH氧化酶是平滑肌細胞遷移過程中的一個重要環(huán)節(jié)。有研究還發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶亦參與SMCs增殖過程［8］。因此，抗氧化劑可能通過降低NADPH氧化酶的活性進而降低SMCs的增殖遷移能力。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度Hcy誘導后，SMCs的NADPH氧化酶活性呈劑量依賴性逐漸上升，與ROS的生成相一致。DPI是NADPH氧化酶特異性抑制劑，可與NADPH氧化酶的核黃素結(jié)合，從而抑制電子的傳遞，阻斷ROS生成途徑。用DPI預孵育0.5 h可基本抑制NADPH氧化酶活性，使ROS生成下降，并明顯減少200 μmol/L Hcy誘導的SMCs的增殖和遷移。提示Hcy誘導的SMCs ROS的產(chǎn)生主要來源于NADPH氧化酶。

ROS主要通過激活MAPK家族及其下游轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB)產(chǎn)生氧化應激反應。本研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK阻斷劑SB203580預孵育0.5 h，再與200 μmol/L Hcy共孵育 24 h，可明顯減少 200 μmol/L Hcy誘導的SMCs增殖和遷移，提示MAPK信號途徑參與了Hcy介導的SMCs增殖和遷移能力的調(diào)節(jié)。MAPK屬絲氨酸/蘇氨酸激酶(Ser/Thr)，其家族成員包括 ERK1/2、P38 MAPK、JNK。其中 p38 MAPK可以被細胞外應激源(紫外線、缺氧、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素)等激活，廣泛參與細胞增殖、遷移和炎癥反應等過程，被認為是細胞外信號引起細胞增殖反應的細胞內(nèi)信號傳遞的共同通路或匯聚點。在ERK和JNK途徑中，ROS刺激使細胞內(nèi)Raf-1明顯升高［12］，Raf-1被激活后依次激活MAP的上游激酶MAK1和MAK3，催化ERK和JNK激酶的酪氨酸和Ser/Thr同時磷酸化，最終通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達的影響將細胞增殖信號傳遞到細胞核內(nèi)。有研究證實，ROS 增多能增加 p38MAPK 磷酸化［13，14］，而siRNANox能抑制 p38 MAPK 磷酸化［15］;Nox4 的細胞核定位提示細胞核內(nèi)源性ROS的生成可直接干預基因表達并激活絲/蘇氨酸蛋白激酶［16］;氧化應激可使p38 MAPK激活，繼而調(diào)節(jié)下游各種激酶活性，如激活絲裂原應激激酶1和環(huán)磷酸腺苷反應結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子，最終導致基因表達的改變，影響細胞的增殖和遷移［13～15］。

綜上所述，Hcy對SMCs增殖和遷移活性具有促進作用，其機制可能與激活NADPH氧化酶、增加ROS生成、活化p38 MAPK信號途徑有關(guān)。

［1］Bao XM，Wu CF，Lu GP.Atorvastatin attenuates homocysteine-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells via inhibiting NADPH oxidase-related oxidative stress-triggered p38MAPK signaling［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30(10):1392-1398.

［2］Bao XM，Wu CF，Lu GP.Atorvastatin inhibits homocysteine-induced oxidative stress and apoptosis in endothelial progenitor cells involving Nox4 and p38MAPK［J］.Atherosclerosis，2010，210(1):114-121.

［3］Rasmussen LM，Hansen PR，Ledet T.Homocysteine and the production of collagens，proliferation and apoptosis in human arterial smooth muscle cells［J］.APMIS，2004，112(9):598-604.

［4］Guthikonda S，Haynes WG.Homocysteine:role and implications in atherosclerosis［J］.Curr Atheroscler Rep，2006，8(2):100-106.

［5］Shi YF，Chi JF，Tang WL，et al.Effects of rosuvastatin on the production and activation of matrix metalloproteinase-2 and migration of cultured rat vascular smooth muscle cells induced by homocysteine［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2013，14(8):696-704.

［6］Papatheodorou L，Weiss N.Vascular oxidant stress and inflammation in hyperhomocysteinemia［J］.Antioxid Redox Signal，2007，9(11):1941-1958.

［7］Schr?der K，Helmcke I，Palfi K，et al.Nox1 mediates basic fibroblast growth factor-induced migration of vascular smooth muscle cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(8):1736-1743.

［8］Valente AJ，Yoshida T，Murthy SN，et al.Angiotensin Ⅱ enhances AT1-Nox1 binding and stimulates arterial smooth muscle cell migration and proliferation through AT1，Nox1，and interleukin-18［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，303(3):H282-H296.

［9］Bruder-Nascimento T，Chinnasamy P，Riascos-Bernal DF，et al.AngiotensinⅡinduces Fat1 expression/activation and vascular smooth muscle cell migration via Nox1-dependent reactive oxygen species generation［J］.J Mol Cell Cardiol，2014，(66):18-26.

［10］ Valente AJ，Yoshida T，Izadpanah R，et al.Interleukin-18 enhances IL-18R/Nox1 binding，and mediates TRAF3IP2-dependent smooth muscle cell migration.Inhibition by simvastatin［J］.Cell Signal，2013，25(6):1447-1456.

［11］Lo IC，Shih JM，Jiang MJ.Reactive oxygen species and ERK 1/2 mediate monocyte chemotactic protein-1-stimulated smooth muscle cell migration［J］.J Biomed Sci，2005，12(2):377-388.

［12］Yu C，Rahmani M，Almenara J，et al.Induction of apoptosis in human leukemia cells by the tyrosine kinase inhibitor adaphostin proceeds through aRAF-1/MEK/ERK-and AKT-dependent process［J］.Oncogene，2004，23(7):1364-1376.

［13］Zou T，Yang W，Hou Z et al.Homocysteine enhances cell proliferation in vascular smooth muscle cells:role of p38 MAPK and p47phox［J］.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2010，42(12):908-915.

［14］El-Remessy AB，Tang Y，Zhu G，et al.Neuroprotective effects of cannabidiol in endotoxin-induced uveitis:critical role of p38 MAPK activation［J］.Mol Vis，2008，(14):2190-2203.

［15］Abid MR，Spokes KC，Shih SC，et al.NADPH oxidase activity selectively modulates vascular endothelial growth factor signaling pathways［J］.J Biol Chem，2007，282(48):35373-35385.

［16］Kuroda J，Nakagawa K，Yamasaki T，et al.The superoxide-producing NAD(P)H oxidase Nox4 in the nucleus of human vascular endothelial cells［J］.Genes Cells，2005，10(12):1139-1151.