米口袋不同萃取部位體外抑菌活性研究

韓毅麗，張娟娟，張淑蓉

（山西中醫(yī)學院，山西太原 030024）

米口袋（Gueldenstaedtia multiflora Bge.）是豆科米口袋屬植物，主要分布于我國東北、華北及陜西、甘肅等省區(qū)，全草及根做“地丁”入藥，陜西關中地區(qū)做“紫花地丁”用，有清熱解毒、涼血消腫的功效，臨床可用于治療咽炎、乳腺炎、目赤腫痛等病癥［1］。近年來，對米口袋藥理活性的研究正逐漸興起，多項研究結果顯示，米口袋具有抗菌消炎、清除自由基及抗氧化、興奮子宮、鎮(zhèn)痛、增強免疫功能等藥理作用［2-5］。但未見對米口袋不同溶媒萃取部位抗菌消炎作用研究的詳細報道，其抗菌消炎的有效部位尚未確定。因此，本實驗利用體外抑菌實驗，通過藥敏紙片法測定米口袋不同溶媒萃取部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌和肺炎鏈球菌四種引起炎癥的常規(guī)致病菌的抑菌圈直徑，初步確定米口袋抗菌消炎的有效部位，為米口袋活性成分的提取分離及新的抗菌藥物的開發(fā)研究奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 試藥

米口袋全草購自河北安國冷背藥材市場，并由山西中醫(yī)學院中藥鑒定教研室王兵老師鑒定。

95%乙醇、石油醚（60℃～90℃）、氯仿（分析純）、乙酸乙酯（分析純，購自天津市光復科技發(fā)展有限公司；正丁醇（分析純，天津市進豐化工有限公司）、Mueller-Hinton瓊脂（編號HB62323，青島高科園海博生物技術有限公司）、NaOH（分析純）、蛋白胨（北京博興生物技術有限公司）、氯化鈉（分析純，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心）、牛肉膏（批號：20131218，北京博興生物技術有限公司）。

金黃色葡萄球菌（山西生物應用職業(yè)技術學院微生物實驗室提供），枯草桿菌（山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院提供），肺炎鏈球菌（編號：GIM1550，廣東省微生物菌種中心），白色念珠菌（白色假絲酵母，編號：GIM2.169，廣東微生物菌種中心）。

1.2 儀器

真空水浴泵（上海豫康科教儀器設備有限公司）、超聲提取器、雙圈定性濾紙（杭州沃華濾紙有限公司）、Finnpipette單道移液器、TH-8D空氣恒溫振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、BBSDDL超凈工作臺、LMQ·R-32608立式滅菌器、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、JA2603B電子天平。

2 方法與結果

2.1 不同萃取部位的制備

2.1.1 水煎液及不同萃取部位的制備 取米口袋藥材 100g，加水 1200mL浸泡 1h，再煎煮 2.5h，過濾；第2次加水800mL煎煮2h，過濾；第3次加水800mL煎煮1.5h，過濾，合并濾液，經(jīng)減壓抽濾后，揮干溶劑稱重，置于干燥器中備用。

按上述方法制備米口袋水煎液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并各萃取液，將各萃取液及萃取后的剩余水提液揮干溶劑后稱重，置于干燥器中備用［6］。

2.1.2 醇浸液及不同萃取部位的制備 取米口袋藥材100g，加65%乙醇700mL，浸漬7d后過濾，再經(jīng)減壓抽濾后回收溶劑，轉移至蒸發(fā)皿中，揮干溶劑后稱重，置于干燥器中備用。

按上述方法制備米口袋醇浸液總浸膏后，加60mL石油醚，超聲萃取50min，靜置20min，分離萃取液，連續(xù)提取3次，合并石油醚萃取液并揮干溶劑后稱重，置于干燥器中備用。按照石油醚萃取步驟再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，得到不同萃取部位及剩余藥液浸膏。

2.2 各菌不同濃度菌懸液的制備

2.2.1 供試菌株的制備 準確稱取牛肉膏3g，加1000mL蒸餾水適量使充分溶解，后加入蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂33g和剩余的蒸餾水，待完全溶解后，121℃滅菌20min，趁熱倒入已滅菌的試管中，將試管加棉塞后傾斜放置使培養(yǎng)基鋪滿試管壁，待完全凝固后，將供試的細菌菌種用無菌接種環(huán)劃線移接到相應的試管斜面固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，冷藏備用［7-9］。

2.2.2 液體培養(yǎng)基的制備 準確稱取牛肉膏1.5g，加500mL蒸餾水適量，加熱攪拌至充分溶解，后加入蛋白胨5g，氯化鈉2.5g及剩余的蒸餾水。待完全溶解后，用1%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，再于121℃滅菌20min，取出后分裝到各個已滅菌的試管中備用［7-9］。

2.2.3 不同濃度菌懸液的制備 從試管斜面固體培養(yǎng)基上挑取一個菌落，放入盛有5mL液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕晃動試管，放入搖床內(nèi)37℃搖動培養(yǎng)24h，吸取1000μL，放入盛有9mL液體培養(yǎng)基的試管中，用迷你振蕩器充分搖勻，再吸取該菌懸液1000μL置于另一盛有9mL無菌液體培養(yǎng)基的試管中，混勻，連續(xù)操作5次，分別得到稀釋倍數(shù)為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的菌懸液備用［7-9］。

2.3 菌懸液最佳稀釋倍數(shù)的確定

吸取200μL各類菌不同稀釋倍數(shù)的菌懸液，置于鋪好的平板中央，均勻涂布菌懸液，靜置5min，37℃培養(yǎng)24h，觀察各類菌的菌落生長情況，以菌落密集、輕薄、均勻生長為佳，從而確定各類菌菌懸液的最佳稀釋倍數(shù)［7-9］，結果見表 1。

表1 各菌菌懸液最佳稀釋倍數(shù)

2.4 最佳抑菌藥量的確定

用0.2g/mL的米口袋水提物制成含藥量分別為 6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg的藥敏片，以蒸餾水藥敏片為陰性對照，按順序放入最佳濃度菌懸液中，37℃培養(yǎng)24h，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑［7-9］，確定了不同菌的最佳抑菌藥量分別為：金黃色葡萄球菌10mg，枯草桿菌、白色念珠菌及肺炎鏈球菌均為12mg，結果見表2。

表2 不同藥量對各類菌的抑菌直徑 （mm）

2.5 體外抑菌效果的測定

將不同萃取部位制備成0.2g/mL的藥液，根據(jù)K-B藥敏紙片擴散法［10］，按照最佳抑菌藥量制作成相應的藥敏紙片，并放入按最佳稀釋倍數(shù)制備好的各菌菌懸液中，貼于培養(yǎng)基表面，以相應的溶劑空白作為陰性對照，待藥敏片完全吸附后，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，平行實驗2次，結果見表3。

表3 不同萃取部位對各菌的抑菌圈直徑 （mm）

根據(jù)藥物實驗敏感判定標準（見表4）及各部位抑菌圈直徑可見：米口袋不同萃取部位對4種菌的抑菌活性不同，米口袋水煎液石油醚萃取部位對金黃色葡萄球菌達到了中度敏感；米口袋水煎液石油醚、氯仿萃取部位及65%醇浸液乙酸乙酯萃取部位對枯草桿菌達到了中度敏感；米口袋65%醇浸液石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部位對肺炎鏈球菌達到了中度敏感。水煎液石油醚萃取部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌的抑菌效果均略大于水煎液氯仿部位，而65%醇浸液氯仿萃取部位對肺炎鏈球菌的抑菌效果最強。米口袋65%醇浸液氯仿萃取部位對肺炎鏈球菌的抑菌活性要強于水煎液氯仿萃取部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及白色念珠菌的抑菌活性。

表4 藥物敏感實驗判定標準

3 討 論

通過實驗發(fā)現(xiàn)米口袋對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌、肺炎鏈球菌的抑菌活性均能達到中度敏感，說明米口袋對這4種菌有較強的抑制作用。并且，米口袋不同萃取部位對不同菌的抑菌活性不同，所以米口袋的抗菌效果及能否作為一種常規(guī)中藥還有待進一步的研究開發(fā)。此外，根據(jù)抗菌藥物需達到中度敏感的要求和抑菌圈直徑可以看出米口袋抗菌消炎功能的有效部位主要是米口袋水煎液的石油醚、氯仿部位及65%醇浸液的石油醚、氯仿和乙酸乙酯部位。

米口袋抗菌消炎有效部位的研究將為米口袋藥效的提高和新的抗菌藥物的開發(fā)提供進一步的研究依據(jù)。

［1］韓毅麗，高黎明，魏太寶.米口袋揮發(fā)油化學成分研究［J］.山西中醫(yī)學院學報，2010，11（1）：18-20.

［2］王軍憲，朱蓉.米口袋的化學成分研究［J］.西北植物學報，1989，9（2）：127-130.

［3］黃海蘭，徐波.米口袋抗食用油脂氧化活性及其成分研究［J］.食品科學，2006，27（11）：93-96.

［4］朱蓉，朱大元，徐任生，等.地丁化學成分的研究［J］.中草藥，1984，15（8）：1.

［5］劉紅燕.甜地丁生藥學研究［D］.濟南：山東中醫(yī)藥大學，2009.

［6］韓毅麗，高黎明.米口袋化學成分的研究［J］.山西中醫(yī)學院學報，2009，10（5）：24-25，66.

［7］中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國臨床檢驗操作規(guī)程（第三版）［M］.南京：東南大學出版社，1997：556-561.

［8］尚彩玲，都華偉，薛慧清.青翹正丁醇部位的抑菌研究［J］.山西中醫(yī)學院學報，2013，14（1）：35-38.

［9］徐威.微生物學實驗［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2004：40.

［10］路福平.微生物學［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1988：14-16.