糖腎寧對自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織HGF表達的影響

劉迎新 鄒大威 耿建國* 高彥彬 尚雅文 李嬌陽 龔慕辛 彭麒朕

(1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中醫(yī)臨床基礎學系，北京100069;2.中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京100069)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是一種糖尿病最常見和最嚴重的慢性微血管合并癥之一，是終末期腎衰竭的主要原因，也是糖尿病患者致死致殘的重要原因之一。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)可促進腎上皮細胞增生遷移、細胞外基質(zhì)的降解，減輕腎小球硬化，為保護腎組織和促進腎損害生長修復的一種多功能細胞因子［1-2］，具有抑制腎臟纖維化的作用，在DN發(fā)展過程中受到了越來越多的關注。本實驗采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠模型，通過觀察糖腎寧對糖尿病小鼠腎組織HGF蛋白表達的影響，探討糖腎寧防治DN的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1)實驗動物:8周齡SPF級雄性KK-Ay小鼠60只，8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠20只，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物合格證號:SCXK(京)2014-0004。整個實驗過程中，KK-Ay小鼠喂以高脂飼料(購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號:SCXK(京)2009-0008)，C57BL/6J喂以全價營養(yǎng)飼料(購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，合格證號:SCXK(京)2014-0010)。

2)藥物:糖腎寧(主要為黃芪、金櫻子、川芎、大黃等，由首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中藥制劑室制備成浸膏粉);纈沙坦膠囊(商品名:代文，規(guī)格:80 mg/粒，批號X1448，北京諾華制藥有限公司)。

3)主 要 試 劑:MouseHGF Antibody(R＆D，AF2207)，糖化血紅蛋白試劑盒(膠乳凝集反應法)(Prodia diagnostics，試劑貨號:LD11602，生產(chǎn)批號:070863A)，肌酐測定試劑盒(苦味酸法)(中生北控生物科技股份有限公司，試劑貨號:0320，生產(chǎn)批號:143011)，尿素測定試劑盒(酶偶聯(lián)速率法)(中生北控生物科技股份有限公司，試劑貨號:0280，生產(chǎn)批號:141141)。

4)儀器:電子天平(YP601N，上海精密科學儀器有限公司)，血糖儀(One touch ultra，強生中國醫(yī)療器械有限公司)，半自動生化儀(URIT-810，桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司)，全自動生化儀(Mindray-BS800，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)等。

1.2 方法

1)模型建立及分組:選用8周齡雄性KK-Ay小鼠60只，高脂飼料喂養(yǎng)4周后，隨機測血糖≥16.7 mmol/L，且24 h尿微量白蛋白尿明顯增多視為糖尿病腎病造模成功。將造模成功的KK-Ay小鼠根據(jù)隨機血糖采用分層隨機法分為模型組(model group，M)、纈沙坦組(valsartan group，X)和糖腎寧組(traditional Chinese medicine group，T)，每組各20只;同時設立8周齡雄性C57BL/6J小鼠20只為空白組(normal group，N)。纈沙坦組按照10 mg·kg-1·d-1灌胃，糖腎寧組按照20 g·kg-1·d-1灌胃，模型組及空白組予等量蒸餾水灌胃，實驗期間自由飲食，連續(xù)給藥12周。

2)標本采集:24周齡時，末次給藥后以5%水合氯醛按0.01 mL/g質(zhì)量腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血，不抗凝血離心后留取血清，摘雙側(cè)腎臟，去包膜，取皮質(zhì)液氮速凍。血液標本及腎組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)測定糖化血紅蛋白(hemoglobinA1c，HbA1c)、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)的測定:HbA1c利用全自動生化儀采用膠乳凝集反應法檢測;SCr采用苦味酸法檢測;BUN采用酶偶聯(lián)速率法檢測。操作步驟參見說明書。

4)Western blotting法檢測腎組織中HGF的蛋白表達:取腎組織裂解后的上清液檢測總蛋白，每個樣品取40 μg蛋白含量的粗提液在10%SDS-PAGE膠上電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜;5%TBS-T脫脂奶粉封閉振蕩1 h，采用HGF抗體4℃ 孵育過夜，10 min ×3次洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗37℃振蕩1 h，用大量 TBS-T漂洗液10 min×3次;洗膜后用ECL試劑暗室內(nèi)膠片曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)統(tǒng)計描述依據(jù)正態(tài)性檢驗結(jié)果采用均數(shù)±標準差(±s)表示，多組之間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較如果方差齊采用Dunnet t檢驗，方差不齊采用Tamhane's T2非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠HbA1c的比較

24周齡小鼠HbA1c各組間有差別，方差不齊(F=52.362，P=0.000)。與空白組相比，模型組HbA1c顯著升高(P＜0.05);與模型組相比，纈沙坦和糖腎寧組無明顯變化(P＞0.05)，詳見表1。

表1 各組小鼠HbA1c的比較Tab.1 Comparison of HbA1c among four groups of mice(±s)

表1 各組小鼠HbA1c的比較Tab.1 Comparison of HbA1c among four groups of mice(±s)

*P＜0.05 vs group N;N:normal group;M:model group;X:valsartan group;T:traditional Chinese medicine group;HbA1c:hemoglobin A1c.

Group Number of cases HbA1c/%16 5.29±0.53 M 15 12.97±2.77*N X 15 12.25±2.12 15 12.04±1.81 T

2.2 各組小鼠BUN、SCr的比較

24周齡小鼠BUN及SCr各組間有差別，方差齊(BUN:F=8.841，P=0.000;SCr:F=32.729，P=0.000)。與空白組相比，模型組SCr、BUN明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，纈沙坦、糖腎寧組小鼠SCr、BUN均有不同程度的降低(P＜0.05)，各干預組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表2。

表2 各組小鼠BUN、SCr的比較Tab.2 Comparison of BUN and SCr among four groups of mice (±s)

表2 各組小鼠BUN、SCr的比較Tab.2 Comparison of BUN and SCr among four groups of mice (±s)

*P ＜0.05 vs group N，#P ＜0.05 vs group M;N:normal group;M:model group;X:valsartan group;T:traditional Chinese medicine group;.BUN:blood urea nitrogen;Scr:serum creatinine.

Group Number of case BUN/(mmol·L-1) SCr/(μmol·L-1)N 12 9.32±2.54 18.70±1.66 M 12 13.42±1.95* 27.28±2.31*X 12 10.95±1.69# 23.69±2.03#T 12 10.68±1.65# 24.14±2.50#

2.3 各組小鼠HGF蛋白表達的比較

Western blotting法檢測結(jié)果表明:與空白組比較，模型組、纈沙坦組、糖腎寧組小鼠HGF相對蛋白表達量顯著減少(P＜0.05);與模型組比較，糖腎寧及纈沙坦組相對蛋白表達量顯著增多(P＜0.05)，糖腎寧組及纈沙組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織HGF蛋白表達比較Fig.1 Hepatocyte growth factor(HGF)expression of each group

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為DN的病理改變主要是以腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生為特征的腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化［3］。HGF是腎組織營養(yǎng)因子，可刺激基質(zhì)的降解，減少腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，改善腎功能?？捎沙扇四I臟腎小球系膜細胞、內(nèi)皮細胞和腎小管間質(zhì)細胞表達［4］。HGF通過失活糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制炎性反應因子核因子 κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、信號傳導蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)、單核趨化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)、細胞間黏附因子-1(intercellular adhersion molecule，ICAM-1)等的激活，緩解腎臟炎性反應［5］。還可抑制致轉(zhuǎn)化生長因子 β1(trans-forming growth factor beta1，TGF-β1)的作用，抑制DN腎間質(zhì)纖維化，保護腎結(jié)構和維護腎功能［6］。張麗芬等［7］發(fā)現(xiàn) DN 大鼠經(jīng)治療后腎組織中HGF蛋白表達明顯增多，而TGF-β1蛋白表達減少，證實可通過促進HGF表達而抑制TGF-β1表達，從而起到保護腎臟和促進腎組織恢復的作用。體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，外源性HGF可激活基質(zhì)降解途徑，發(fā)揮抗纖維化作用，并促進腎小球腎炎動物毛細血管內(nèi)皮細胞再生而加速受損組織修復［8］。由此可見HGF是重要的抗纖維化因子及保護性因子，可延緩DN的發(fā)生與發(fā)展，HGF表達增高對DN腎小球硬化有減緩作用。

中醫(yī)認為DN多因消渴日久不愈，遷延及腎，絡脈瘀阻，腎體受損而成。高彥彬等［9］認為絡病是廣泛存在于糖尿病慢性并發(fā)癥中的病理狀態(tài)，也是糖尿病慢性并發(fā)癥共同的病理基礎。因此將絡病理論引入中醫(yī)藥防治DN的研究，認為DN的基本病機是腎氣不固、腎絡瘀滯［10］，并創(chuàng)制中藥復方制劑糖腎寧。糖腎寧由黃芪、金櫻子、大黃、川芎等藥物組成。方中黃芪味甘，性微溫，益氣扶正;金櫻子味酸澀，性平，固精縮尿;大黃味苦，性寒，逐瘀清熱降濁，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰:“大黃，……主下瘀血;……破癥瘕、積聚;留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”;川芎味辛，性溫，活血化瘀通絡。全方共奏益氣固腎、化瘀通絡之功。臨床采用糖腎寧治療DN也獲得了較好的療效［11-14］。

本實驗研究證實，糖腎寧可明顯降低KK-ay小鼠BUN、SCr，促進腎組織中HGF蛋白的表達，保護腎臟功能，抑制纖維化的進展。推測糖腎寧防治DN的作用可能與促進HGF蛋白的過度表達有關，其詳細機制還有待進一步深入研究。

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