金頂側(cè)耳原生質(zhì)體制備與再生條件的研究

張亞嬌 陳淮潔 盧木造 朱 堅(jiān)*

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金頂側(cè)耳原生質(zhì)體制備與再生條件的研究

張亞嬌1,2陳淮潔1盧木造1朱 堅(jiān)1,2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002 ）

采用單因素以及正交試驗(yàn)法探究金頂側(cè)耳原生質(zhì)體的制備及再生條件，結(jié)果顯示：加富PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5天的菌絲，在以蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑配制2%濃度的溶壁酶條件下，30 ℃酶解2.5 h，原生質(zhì)體得率為2.36×107個(gè)/mL；選擇蔗糖再生培養(yǎng)基，再生率可達(dá)0.71%。

金頂側(cè)耳；原生質(zhì)體；制備；再生；正交試驗(yàn)

金頂側(cè)耳（Sing.）隸屬傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，別名金頂蘑、榆黃蘑[1]，具有降低血脂、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抑制腫瘤、抗疲勞等多種營(yíng)養(yǎng)保健功效[2]。原生質(zhì)體的研究在食用菌育種中具有重要意義，有關(guān)金頂側(cè)耳的研究目前大多集中在栽培方法、子實(shí)體蛋白質(zhì)和多糖的提取、液體菌種應(yīng)用、深加工等方面，對(duì)其原生質(zhì)體的制備與再生研究少見報(bào)道。而筆者則較為系統(tǒng)地研究了金頂側(cè)耳原生質(zhì)體制備與再生的適宜條件，為今后新品種的選育、原生質(zhì)體融合及遺傳轉(zhuǎn)化等研究工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為金頂側(cè)耳Pl.c0001，由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供。

1.2 培養(yǎng)基配方

試管斜面培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%。PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%。加富PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.05%，維生素B10.001%。MYG培養(yǎng)基：葡萄糖1%，麥芽糖 0.5%，酵母粉 0.5%。再生培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，酵母粉0.3%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，維生素B10.001%，瓊脂2%，穩(wěn)滲劑0.6 mol/L。以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 試劑

溶壁酶由廣東省微生物研究所提供，溶壁酶液和穩(wěn)滲液分別用蔗糖、甘露醇、山梨醇、MgSO4·7H2O、KCl配制。

1.4 方法

（1）穩(wěn)滲液的配制。分別精確稱取相應(yīng)質(zhì)量的蔗糖、甘露醇、山梨醇、MgSO4·7H2O、KCl溶于去離子水中，用容量瓶定容至終濃度為0.6 mol/L，高壓滅菌后備用。

（2）酶液配制。用0.6 mol/L的穩(wěn)滲劑溶解適量的溶壁酶，分別配成酶濃度（/）為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的溶壁酶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

（3）菌絲培養(yǎng)。首先將試管母種在斜面培養(yǎng)基（PDA）上進(jìn)行活化，28 ℃培養(yǎng)7～8天后轉(zhuǎn)接到含有碎玻璃的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，每天搖床培養(yǎng)0.5 h（28 ℃，150 r/min），獲得純菌絲片斷。

（4）原生質(zhì)體制備與計(jì)數(shù)。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的菌齡，吸取相應(yīng)培養(yǎng)天數(shù)的菌絲至無(wú)菌的帶蓋離心管中，6 500 r/min離心15 min后去上清液，再用無(wú)菌水和相應(yīng)的穩(wěn)滲劑先后洗滌菌絲1次。每100 mg濕菌絲加1 mL酶液，在相應(yīng)水浴溫度下酶解一定時(shí)間。反應(yīng)過程中每15 min輕微振蕩一次離心管，待酶解完畢時(shí)，吸取少量酶解液進(jìn)行顯微鏡觀察并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

（5）原生質(zhì)體純化。將制備的原生質(zhì)體懸液用厚0.5 cm的無(wú)菌脫脂棉過濾，去除未酶解充分的菌絲，再經(jīng)離心去除酶液。將離心后的原生質(zhì)體沉淀用穩(wěn)滲液洗滌2次，重新懸浮在等體積的穩(wěn)滲液中，即得到純化的原生質(zhì)體懸液。

（6）原生質(zhì)體制備條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將上述菌絲液體培養(yǎng)基分別設(shè)為PDA液體培養(yǎng)基、加富PDA液體培養(yǎng)基、MYG培養(yǎng)基。酶濃度設(shè)1%、1.5%、2%、2.5%、3%，酶解時(shí)間設(shè)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，酶解溫度設(shè)26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，菌齡設(shè)3天、5天、7天、9天、11天，穩(wěn)滲劑為蔗糖、甘露醇、山梨醇、MgSO4·7H2O、KCl，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

（7）原生質(zhì)體制備條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取酶解時(shí)間、菌齡和穩(wěn)滲劑3個(gè)因素，以金頂側(cè)耳原生質(zhì)體產(chǎn)量為指標(biāo)，按照L9(34)正交表做正交試驗(yàn)，對(duì)原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，水平因素見表1。

表1 原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化試驗(yàn)因素水平

（8）原生質(zhì)體再生。取100 μL純化的原生質(zhì)體懸液涂布于含有不同種類穩(wěn)滲劑的固體再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。為了減少殘存菌絲片斷再生形成的菌落所產(chǎn)生的誤差，將原生質(zhì)體用無(wú)菌的蒸餾水進(jìn)行稀釋，待脹破后再涂平板培養(yǎng)作為對(duì)照。每10皿為一個(gè)處理。以上平板均放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待3～4天菌落形成時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

（9）原生質(zhì)體再生率的計(jì)算。參考王謙等的計(jì)算方法[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

（1）培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)采用PDA液體、加富PDA液體，以及MYG3種培養(yǎng)基對(duì)供試菌株進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，金頂側(cè)耳菌絲最先在MYG培養(yǎng)基中萌發(fā)，培養(yǎng)至5天時(shí)，加富PDA液體培養(yǎng)基中菌絲量最多。以甘露醇為穩(wěn)滲劑，用2%的溶壁酶在30 ℃下酶解3 h時(shí)，加富PDA液體培養(yǎng)基得到的原生質(zhì)體數(shù)目最多，MYG培養(yǎng)基為次，PDA液體培養(yǎng)基最少（圖1）。

圖1 培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

（2）酶濃度。選擇加富PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5天的菌絲，以甘露醇為穩(wěn)滲劑，用不同濃度的酶溶液在30 ℃下酶解3 h，結(jié)果如圖2。其中，溶壁酶濃度在2.0%時(shí)產(chǎn)量最高，達(dá)到7.99×106個(gè)/mL，3.0%時(shí)最低，為1.23×106個(gè)/mL。由此看出，酶濃度過低或過高原生質(zhì)體產(chǎn)量都較低，2%為較佳酶解濃度。

圖2 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

（3）酶解時(shí)間。選擇2%酶濃度，加富PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5天的菌絲，以甘露醇為穩(wěn)滲劑，30 ℃下酶解不同時(shí)間，結(jié)果如圖3：酶解時(shí)間為2 h時(shí)，原生質(zhì)體表現(xiàn)出最大釋放量，此時(shí)產(chǎn)量為9.83×106個(gè)/mL，之后隨著酶解時(shí)間的增加，產(chǎn)量開始下降。因此，確定2 h為金頂側(cè)耳較佳酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

（4）酶解溫度。選擇加富PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5天的菌絲，以甘露醇為穩(wěn)滲劑，2%濃度的酶在不同酶解溫度下酶解2 h，結(jié)果如圖4：在溫度低于30 ℃時(shí)，隨著溫度的升高酶解反應(yīng)加快，原生質(zhì)體的數(shù)目呈現(xiàn)出先迅速增加后趨于平緩增加的態(tài)勢(shì)；當(dāng)溫度超過30 ℃后，原生質(zhì)體產(chǎn)量開始降低。這可能是由于溫度過高，造成酶失活，破壞原生質(zhì)體膜的結(jié)構(gòu)，使其活性降低，甚至變形、裂解。因此，確定30 ℃為酶解反應(yīng)的較佳溫度。

圖4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

（5）菌齡。選擇2%酶濃度，加富PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天的菌絲，以甘露醇為穩(wěn)滲劑，30 ℃下酶解2 h，結(jié)果如圖5：菌絲培養(yǎng)5天時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)目最多，達(dá)到1.03×107個(gè)/mL。之后隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，菌絲開始老化，原生質(zhì)體產(chǎn)量降低。當(dāng)菌絲長(zhǎng)到11 天時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量降低到105數(shù)量級(jí)。

圖5 菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

（6）穩(wěn)滲劑。原生質(zhì)體在分離、再生及融合過程中都離不開滲透壓穩(wěn)定劑的保護(hù)。由圖6可以看出，有機(jī)糖醇類的穩(wěn)滲劑比無(wú)機(jī)鹽更適合金頂側(cè)耳原生質(zhì)體的制備，其中，以蔗糖為穩(wěn)滲液制備出的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為1.87×107個(gè)/mL，明顯高于其他4種穩(wěn)滲劑，KCl最低。

圖6 穩(wěn)滲劑種類對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.2 復(fù)合因素對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

運(yùn)用DPS7.05軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各處理平均數(shù)間的多重比較采用鄧肯式新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)（Duncan,s New Multiple Range Test），差異顯著性水平定為α=0.05，差異極顯著水平定為α=0.01進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 原生質(zhì)體制備條件正交試驗(yàn)及結(jié)果

注：K為制備均值、R為制備極差。

由表2可知，各因素對(duì)原生質(zhì)體制備結(jié)果產(chǎn)生影響的大小順序依次為穩(wěn)滲液（C）>酶解時(shí)間（A）>菌齡（B），最優(yōu)組合為A2B2C3。穩(wěn)滲液（C）為蔗糖時(shí)，差異達(dá)到極顯著，這可能是蔗糖相比其他穩(wěn)滲劑提供了更多的能源物質(zhì)，為原生質(zhì)體的穩(wěn)定存在創(chuàng)造了更有利的環(huán)境。酶解時(shí)間（A）為2.5 h時(shí)，差異極顯著。菌齡（B）為5天的菌絲釋放的原生質(zhì)體數(shù)目最多，差異達(dá)到極顯著，3天和7天的差異不顯著，可能是3天時(shí)菌齡過小，生成的菌絲量少，形成率低；7天時(shí)菌齡過大，由于營(yíng)養(yǎng)等原因，菌絲對(duì)外界的抵御能力增強(qiáng)，而不利于原生質(zhì)體的制備。因此最優(yōu)組合為以蔗糖為穩(wěn)滲液，酶解2.5 h，培養(yǎng)5天，此時(shí)菌絲釋放的原生質(zhì)體數(shù)目最多。

2.3 再生培養(yǎng)基種類對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響

據(jù)部分文獻(xiàn)報(bào)道[4～6]，選擇有機(jī)糖醇類的物質(zhì)作為反應(yīng)的穩(wěn)滲劑比無(wú)機(jī)鹽類更適合原生質(zhì)體的再生。所以本實(shí)驗(yàn)并沒有就無(wú)機(jī)鹽類穩(wěn)滲劑對(duì)再生的影響做深入研究。由表3可知，本實(shí)驗(yàn)甘露醇作為穩(wěn)滲劑時(shí)，金頂側(cè)耳的再生率很低，僅0.43%；蔗糖較高，為0.71%。

表3 不同再生培養(yǎng)基原生質(zhì)體的再生率

注：以上結(jié)果均為10次重復(fù)的平均值。

3 討 論

本研究表明，金頂側(cè)耳原生質(zhì)體最佳制備條件為：以0.6 mol/L蔗糖為穩(wěn)滲劑，配制濃度為2%的酶液，在30 ℃條件下對(duì)加富PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的菌絲酶解2.5 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量可高達(dá)2.36×107個(gè)/mL。其在蔗糖培養(yǎng)基上的再生率較高，達(dá)0.71%。

成功制備出原生質(zhì)體以及保證其正常的再生是對(duì)其進(jìn)行遺傳操作的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用了單一酶即溶壁酶，通過酶解法制備原生質(zhì)體，運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)，分別從多個(gè)相關(guān)因素進(jìn)行優(yōu)化，得到了較高數(shù)量的原生質(zhì)體，以滿足其用于融合、再生及誘變育種、遺傳轉(zhuǎn)化等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度要求。另外，在原生質(zhì)體純化時(shí)，過濾介質(zhì)的選擇，以及洗滌原生質(zhì)體沉淀時(shí)轉(zhuǎn)速的控制也明顯影響其最終得率。本實(shí)驗(yàn)還用2～4層擦鏡紙作為過濾介質(zhì)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體損失率也較高，而離心洗滌原生質(zhì)體時(shí)，轉(zhuǎn)速過低，不利于其有效沉淀，轉(zhuǎn)速過高又會(huì)造成其大量破裂。因此，選擇有效的過濾介質(zhì)并優(yōu)化適合試驗(yàn)菌株的離心轉(zhuǎn)速尚待進(jìn)一步探究。

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Study on preparation and regeneration conditions ofprotoplasts

Zhang Yajiao1,2Chen Huaijie1Lu Muzao1Zhu Jian1,2*

(1.College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002；2.Mycological Research Center of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002)

Theprotoplasts preparation and regeneration conditions were studied by single factor and orthogonal experiment. The highest protoplasts yield with 2.36×107mL-1could be obtained on these conditions：mycelium were cultured in the enriched PDA liquid medium for 5 days, then digested at 30 ℃ for 2.5 h by 2% lywallzyme enzyme that dissolved in 0.6 mol/L sucrose. And the best regeneration rate was 0.71% using sucrose as osmotic pressure stabilizer.

; protoplast; preparation; regeneration; orthogonal experiment

S646

A

2095-0934（2015）01-39-04

國(guó)家星火計(jì)劃重大項(xiàng)目食用菌產(chǎn)業(yè)升級(jí)與可持續(xù)發(fā)展技術(shù)體系示范（編號(hào)：3011GA720008）

張亞嬌（1989—），在讀碩士研究生，主要從事食用菌育種研究。E-mail:yajiao1010@126.com

朱堅(jiān)（1964—），碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事食用菌栽培、育種和加工方面的教學(xué)科研。E-mail：zhujian6469@126.com