清肺口服液對(duì)呼吸道合胞病毒感染小鼠內(nèi)炎性細(xì)胞及Treg/Th17表達(dá)水平的影響

董文閣，袁 斌，周立華，徐建亞，李江全，王明明，孔 飛

0 引 言

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial viral，RSV)為副黏病毒科肺炎病毒屬，是有包膜非片段性的單股負(fù)鏈RNA病毒。RSV是造成嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的主導(dǎo)因素，可引起肺炎和毛細(xì)支氣管炎，還可誘發(fā)慢性阻塞性肺病、過(guò)敏癥和哮喘，并加劇已有的哮喘病癥，嚴(yán)重威脅嬰幼兒健康。RSV病毒感染是嬰幼兒肺炎的主要病原，細(xì)胞免疫功能紊亂在小兒病毒性肺炎發(fā)病機(jī)制中起重要作用［1］。本研究結(jié)合小兒病毒性肺炎痰熱閉肺證的證候特點(diǎn)，在經(jīng)方麻杏石甘湯的基礎(chǔ)上，研制出以開(kāi)肺化痰、解毒活血為主要功效的清肺口服液，并發(fā)現(xiàn)其在治療RSV肺炎方面臨床效果良好［2-4］，但治療機(jī)理的研究不夠深入。因此本研究從細(xì)胞免疫角度探討該藥治療RSV肺炎的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 RSV病毒 呼吸道合胞病毒A亞型(Long株)，保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心液氮罐中，復(fù)蘇并擴(kuò)增后收集病毒，測(cè)感染RSV 后 Hep-2 細(xì)胞 TCID50為 10-3.5/50 μL。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取6～8周齡雌性BALB/c小鼠50只，體重(20±2)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)中心。合格證:SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)溫度(21±2)℃，濕度40% ～70%，光照12 h/d，按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.3 藥品 清肺口服液藥物組成:炙麻黃4 g，杏仁10 g，生石膏24 g，葶藶子 6 g，桑白皮 10 g，紫花前胡10 g，制僵蠶 6 g，丹參 6 g，虎杖 12 g，拳參 12 g。新博林顆粒成分為利巴韋林。

按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)口服液制劑標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)煎煮、濃縮、蒸餾、收取等過(guò)程，制成濃度相當(dāng)于生藥1.33 g/mL和4 g/mL的煎劑。

1.4 試劑 ELASA試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)，胎牛血清及培養(yǎng)基(維森特生物技術(shù)有限公司)，流式細(xì)胞術(shù)試劑盒:Mouse Treg/Th 17 Phenotyping Kit、Leuko-cyte Activation Cocktail，with BD Golgiplug Stain Buffer(FBS)，BD Pharmingen生產(chǎn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀(EXL800型 BioTek，USA)、低溫高速離心機(jī)Centrifuge 5810R、流式細(xì)胞儀(貝克曼CytomicsTMFC 500)、倒置顯微鏡(DMIL，德國(guó) Leica公司)、CO2培養(yǎng)箱(MCO-20，日本SANYO公司)等。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 動(dòng)物分組 將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組:對(duì)照組、模型組、利巴韋林組、清肺高劑量組(4 g/mL)、清肺低劑量組(1.33 g/mL)，每組10只。

1.6.2 RSV模型制備方法 在P1級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠5 d后，分別將各組小鼠置于密封透明容器內(nèi)以乙醚吸入性麻醉，除對(duì)照組外，其余4組均給予 RSV病毒滴入鼻孔制備模型，將TCID50為10-3.5/50μL的RSV病毒稀釋1000倍，每只小鼠50 μL滴鼻，對(duì)照組予等量等滲鹽水刺激，各組小鼠在RSV滴鼻48 h后，給藥72 h即處死。

小鼠肺組織病理采集:實(shí)驗(yàn)結(jié)束剖取小鼠肺小葉，每組5只，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包理，制片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下(×200)閱片，具體過(guò)程參照文獻(xiàn)［5］，根據(jù)小鼠肺組織病理改變程度對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。

1.6.3 給藥濃度 對(duì)照組和模型組給予相應(yīng)0.9%等滲鹽水，清肺高劑量組給予濃度為4 g/mL(相當(dāng)于小兒臨床3倍等效量)的清肺口服液，清肺低劑量組給予濃度為1.33 g/mL(相當(dāng)于小兒臨床等效量)的清肺口服液，利巴韋林組給予濃度為0.0025 g/mL(相當(dāng)于小兒臨床等效量)的利巴韋林，各組小鼠均灌胃給藥，1次/d，給藥3 d后處死。

1.7 實(shí)驗(yàn)測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)中IL-10、IL-17的表達(dá)。

1.7.1 樣本的制備 摘眼球取血處死小鼠后，每組5只，剝離出氣管，用手術(shù)剪在環(huán)狀軟骨處剪口，插入8號(hào)灌胃器針頭并固定，連接1 mL注射器，依次用預(yù)冷的 PBS 0.8、0.6、0.5 mL 沖洗小鼠肺 3 次，每次緩慢用PBS反復(fù)沖洗3次，移至5 mL離心管中，整個(gè)過(guò)程于冰上進(jìn)行保持溫度為4℃，將離心管置于2500 r/min，離心 5 min，取上清。

1.7.2 濃度測(cè)定 依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加樣，溫育，洗滌后用底物顯色，于酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算樣品濃度。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中Treg/Th17細(xì)胞平衡水平 制備單細(xì)胞懸液，將取過(guò)肺組織病理的小鼠，每組4只，摘取新鮮的小鼠脾半葉加人冷的PBS研磨成為單細(xì)胞懸液，每管抽取200 μL左右;根據(jù)流式試劑盒操作流程操作進(jìn)行染色、破膜及固定，最后用流式儀器檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 清肺口服液對(duì)感染RSV肺炎小鼠肺組織的病理改變?cè)u(píng)分結(jié)果 清肺高劑量組、清肺低劑量組、利巴韋林組、對(duì)照組病理改變?cè)u(píng)分［(3.5±0.5)、(4.5 ±0.5)、(2.9 ±0.4)、(0.8 ±0.4)分］較模型組［(5.7 ±0.8)分］降低(P ＜0.01)。

2.2 清肺口服液對(duì)小鼠BALF中IL-10、IL-17表達(dá)的影響 清肺高劑量組、清肺低劑量組、利巴韋林組、對(duì)照組IL-10表達(dá)較模型組均明顯升高(P＜0.01);而 IL-17表達(dá)較模型組均明顯降低(P＜0.01)。清肺高、低劑量組IL-10、IL-17表達(dá)分別較利巴韋林組降低和升高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠BALF中IL-10、IL-17表達(dá)水平比較(x ±s，n=5)Table 1 Expressions of IL-10 and IL-17 in the bronchoalveolar lavage fluid of different groups of rats(x ± s，n=5)

2.3 清肺口服液對(duì)小鼠脾細(xì)胞中Treg、Th17及Treg/Th17表達(dá)的影響 模型組Treg、Treg/Th17表達(dá)較對(duì)照組降低，Th17表達(dá)升高(P＜0.01)。清肺高劑量組、清肺低劑量組、利巴韋林組及對(duì)照組Treg/Th17表達(dá)較模型組均明顯升高(P＜0.01);清肺高、低劑量組Treg、Th17、Treg/Th17表達(dá)與利巴韋林組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠脾細(xì)胞中Treg、Th17表達(dá)水平及Treg/Th17比值比較(x ± s，n=4)Table 2 Expression levels of Treg，Th17，and Treg/Th17 in the spleen of different groups of rats(x ±s，n=4)

3 討 論

RSV感染所致嬰幼兒肺炎以痰熱閉肺證最為多見(jiàn)，清肺口服液為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，系在麻杏石甘湯基礎(chǔ)上經(jīng)制劑改良形成，常用于治療RSV感染痰熱閉肺證，在縮短病程、改善癥狀等方面起到了良好效果［6］。鞏固等［7］研究發(fā)現(xiàn)，清肺口服液治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎療效顯著，優(yōu)于利巴韋林，且不良反應(yīng)極少。RSV病毒感染后，體內(nèi)炎癥細(xì)胞在肺組織中聚集增加［8］。本研究RSV病毒感染后，模型組小鼠肺組織病變主要位于肺間質(zhì)，表現(xiàn)為肺泡壁輕度或中度充血、水腫，致肺泡壁增厚，并有少量或中等量中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡腔內(nèi)無(wú)水腫液，無(wú)炎性滲出物。肺內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞排列輕度紊亂，有輕度變性，無(wú)細(xì)胞壞死，管腔內(nèi)未見(jiàn)滲出物，支氣管周圍組織無(wú)明顯水腫或炎細(xì)胞浸潤(rùn);給藥治療后各組肺組織病變程度較模型組略減輕，肺內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞排列較整齊，腔內(nèi)無(wú)明顯炎性滲出物。與模型組比較，清肺高、低劑量組及利巴韋林組作用于小鼠肺炎中期可有效升高IL-10表達(dá)水平，并可有效降低IL-17表達(dá)水平，有效上調(diào) Treg表達(dá)，下調(diào) Th17表達(dá)，上調(diào)Treg/Th17，表明清肺組及利巴韋林組治療RSV肺炎均有效;清肺高劑量組、清肺低劑量組與利巴韋林組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明清肺高劑量組、清肺低劑量組治療效果略優(yōu)于利巴韋林組;而清肺高劑量組與清肺低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明清肺高劑量組療效并不優(yōu)于清肺低劑量組。清肺口服液療效可能在一定范圍內(nèi)隨著濃度的增加而不斷增強(qiáng)，但本研究中2種濃度的療效差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

RSV肺炎痰熱閉肺證主要病理產(chǎn)物是痰，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“痰”屬于炎癥反應(yīng)范疇，炎性細(xì)胞產(chǎn)生的分泌物可視之為中醫(yī)的“痰”［9］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，RSV感染的發(fā)病機(jī)制除RSV直接導(dǎo)致氣道黏膜受損外，RSV可作為變應(yīng)原誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，一方面清除RSV，另一方面造成免疫損傷。Th17細(xì)胞為能夠分泌IL-17、IL-22等促炎癥因子的T細(xì)胞亞群，Bera等［10］報(bào)道，急性RSV感染會(huì)引起Th17細(xì)胞因子上調(diào)。有研究報(bào)道，Th17細(xì)胞及IL-17在肺組織纖維化早期肺泡炎階段表達(dá)水平增加，可能與誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，分泌IL-17，放大致炎效應(yīng)有關(guān)［11］。Treg細(xì)胞是能分泌IL-10并具有負(fù)調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群［12］。既往研究表明，Treg敲除的急性RSV感染小鼠模型癥狀加重，發(fā)病率上升，體重下降更多，氣道阻塞加劇，揭示Treg細(xì)胞在急性RSV感染中起到重要調(diào)節(jié)作用［13-14］。正常機(jī)體Treg/Th17處于相對(duì)平衡狀態(tài)，RSV感染促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，大量分泌IL-17促炎因子，IL-17促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子，促使氣道黏液腺分泌大量黏液，增加氣道的高反應(yīng)性。Treg細(xì)胞和IL-10綜合作用可抑制炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)［15］，RSV感染可能引起Treg細(xì)胞因子下調(diào)，IL-10分泌減少，從而導(dǎo)致Treg/Th17平衡失調(diào)發(fā)生急性炎癥病變。本研究中模型組IL-17表達(dá)水平明顯上升，Th17細(xì)胞因子上調(diào)，IL-10表達(dá)水平下降，Treg細(xì)胞因子下調(diào)，給藥后能抑制Th17細(xì)胞分化，下調(diào)IL-17表達(dá)水平，減少炎癥因子釋放，可能促進(jìn)IL-10表達(dá)，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化［16］，使紊亂的 Treg/Th17趨于平衡狀態(tài)，進(jìn)而使疾病趨于好轉(zhuǎn)。這也為深入揭示RSV的致病機(jī)制提供了新的思路與方法。

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