血漿DNA定量檢測在慢性白血病患者療效評估中的臨床應(yīng)用

張紅梅，蔣 葉，李大千，夏文穎，陳 丹，荊俊鵬，王 悅，楊大恒，徐 建，潘世揚(yáng)

0 引 言

循環(huán)DNA主要存在于人血漿和血清等體液中，大量研究表明，血漿DNA水平與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，與腫瘤的診斷、治療療效、病程監(jiān)測及預(yù)后密切相關(guān)［1-6］，但在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究報(bào)道相對較少。慢性白血病是一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)腫瘤，慢性白血病細(xì)胞具有一定的分化成熟能力，多為較成熟的幼稚細(xì)胞和成熟細(xì)胞，其病情發(fā)展慢，自然病程可為數(shù)年，其中常見的是慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和毛細(xì)胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)。目前慢性白血病的診斷、療效判斷及病程監(jiān)測在臨床上多依賴骨髓組織細(xì)胞學(xué)檢查。有研究報(bào)道，白血病患者外周血中循環(huán)DNA的異常增高早于骨髓檢查，認(rèn)為血漿循環(huán)DNA可代替骨髓細(xì)胞用于白血病的輔助診斷［7］。因此，本研究以慢性白血病患者為研究對象，初步探討探討血漿循環(huán)DNA定量檢測在慢性白血病療效評估中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2008年5月至2014年8月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和南京市江寧醫(yī)院血液科住院患者CML52例、CLL85例和HCL患者4例。男性99例，女性42例。CML患者中位年齡48歲，其中慢性期33例、急變期12例、加速期7例，經(jīng)酪氨酸酶抑制劑TKI聯(lián)合化療后部分患者達(dá)完全血液學(xué)緩解或細(xì)胞遺傳學(xué)緩解;CLL患者中位年齡61歲，在FC方案或FCR等方案化療后，經(jīng)CLL療效標(biāo)準(zhǔn)判斷［8］，28例患者達(dá)到完全緩解(complete remission，CR)，27例部分緩解(partial remission，PR)，30例未緩解(non-remission，NR)，分別為 CR組、PR組、NR組;HCL中位年齡62歲。選擇南京市江寧醫(yī)院80例體檢健康者作為對照組，男性43例，女性37例，中位年齡45歲。

1.2 試劑與儀器 磁珠法提取DNA試劑盒(上海浩源公司)，PCR擴(kuò)增試劑(TaKaRa公司)。目的基因βactin和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參照物重組質(zhì)粒DNA的引物及TaqMan探針由Invitrogen公司合成，序列參見文獻(xiàn)［9］。7500型熒光定量基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)。

1.3 標(biāo)本處理 采集靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，于室溫1 600×g離心10min，小心轉(zhuǎn)移上層血漿，再于4℃、16 000×g離心10 min，上層無細(xì)胞血漿每管200 μL分裝于加入人工重組質(zhì)粒樣品保存管中，渦旋混勻后置-70℃待測。

1.4 血漿DNA定量檢測 用磁珠法對血漿DNA和重組質(zhì)粒DNA同步提取，再對人β-actin基因和內(nèi)參照質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR，具體操作及計(jì)算參照文獻(xiàn)［9-10］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Stata/SE 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。血漿DNA定量結(jié)果資料呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)［M(P25，P75)］表示，成組設(shè)計(jì)組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Whitney秩和檢驗(yàn);化療前后比較采用Wilcoxon配對秩和檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢性白血病患者診斷時血漿DNA含量的測定診斷時，CML和CLL患者血漿DNA含量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而HCL患者血漿DNA含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.200)，CML、CLL 和 HCL 患者之間血漿 DNA含量差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 CML患者不同階段血漿DNA含量測定 CML慢性期患者血漿DNA含量顯著高于急變期患者和加速期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但加速期患者和急變期患者血漿DNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

2.3 CML患者在化療前后DNA含量測定 CML患者化療后血漿DNA含量顯著低于化療前血漿DNA含量，且顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見表1。

2.4 CLL患者不同化療療效組血漿DNA含量測定CLL患者CR組血漿DNA含量顯著低于PR組和NR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.001);與對照組血漿DNA含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.125)。PR組、NR組血漿DNA含量顯著高于對照組 (P＜0.001)。見表1。

表1 慢性白血病患者不同時期血漿DNA含量的結(jié)果［M(p25，p75)，ng/mL)］Table 1 The level of plasma DNA in patients with chronic leukemia ［(M(p25，p75)，ng/mL］

3 討 論

慢性白血病起病緩慢，病程長，早期多無明顯癥狀，患者多在體格檢查或其他疾病就診時發(fā)現(xiàn)。95%的慢性白血病為CML，CML以慢性期起病，發(fā)病年齡在20～60歲，臨床病程可分為慢性期、加速期及急變期。CLL主要見于老年人，病程進(jìn)展緩慢，中位生存期＞10年。HCL較為少見，白血病細(xì)胞胞質(zhì)形成細(xì)長的突起，形似絨毛，平均發(fā)病年齡50歲，預(yù)后多不良。目前，臨床使用的最直接的判斷慢性白血病化療療效的檢測手段為骨髓穿刺和活檢，但骨髓穿刺為有創(chuàng)檢測。相關(guān)文獻(xiàn)表明，循環(huán)血漿DNA可以作為早期監(jiān)測腫瘤的分子生物標(biāo)記［11-13］，并且可以評判腫瘤化療療效［14］。

循環(huán)DNA為主要存在于血液、滑膜液、腦脊液等體液中的細(xì)胞外DNA。Leon等［15］首先發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿DNA水平明顯增高，且與患者的預(yù)后及療效有關(guān);Stroun等［16］首先對腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán)DNA的序列進(jìn)行了檢測，在腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán) DNA 上相繼檢測到了 K-ras、N-ras、P53、APC等基因的突變［2，4，17-19］。同時發(fā)現(xiàn)癌癥患者在接受化療后，其體內(nèi)游離循環(huán) DNA的濃度會降低到90%［20］，而正常人體內(nèi)的游離循環(huán)DNA的水平就相對穩(wěn)定。隨后在肺癌、乳腺癌、消化道腫瘤等多種實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)血漿DNA具有腫瘤相關(guān)的特征性改變［21-23］，提示循環(huán)DNA有望成為新的腫瘤分子標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，診斷時由于大量白血病細(xì)胞的存在，CML和CLL患者血漿DNA含量均明顯高于對照組;HCL患者血漿DNA含量亦高于對照組但無差異，這可能是樣本數(shù)偏少所致。由此推斷慢性白血病患者體內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞釋放DNA導(dǎo)致血漿DNA水平升高，Stroun等［23］證實(shí)游離循環(huán)DNA先是在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制合成，然后釋放出細(xì)胞，新合成的DNA被優(yōu)先釋放。在CML患者中，慢性期患者血漿DNA含量明顯高于急變期和加速期患者。原因是CML慢性期白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增高，釋放大量DNA，而進(jìn)入加速期和急變期后，由于降白細(xì)胞治療，白細(xì)胞數(shù)量相比慢性期顯著降低;其血漿DNA水平亦相應(yīng)降低。

本研究前期已證實(shí)，血漿DNA定量檢測在AML和ALL的的化療療效評估中均具有重要意義［24-25］。本研究對 CML患者進(jìn)行化療后血漿DNA的定量檢測，其血漿DNA水平顯著低于化療前但顯著高于對照組，結(jié)果表明CML患者在接受化療后病情得到有效控制，但因?yàn)榧膊∵M(jìn)展緩慢，故而病情恢復(fù)亦緩慢。對CLL患者化療后不同療效組血漿DNA水平研究結(jié)果顯示，CR組與對照組之間無差異，提示患者化療效果良好，病情得到有效控制。PR組血漿DNA水平顯著高于對照組及CR組，但顯著低于NR組，結(jié)果提示患者化療后病情有所控制，但治療效果并不理想;或者患者化療前病情嚴(yán)重于CR組患者;抑或患者因個體差異導(dǎo)致治療效果差異。NR組患者化療后血漿DNA水平顯著高于對照組、CR組及PR組，結(jié)果提示該組患者化療效果無效或者治療效果不好，需要進(jìn)一步化療或者更改化療方案。

本研究結(jié)果表明，血漿DNA的定量檢測在慢性白血病的化療療效評價中具有重要的臨床意義。盡管CML已經(jīng)有非常好的分子生物學(xué)療效評估指標(biāo)BCR/ABL，但是BCR/ABL檢測需要通過骨髓穿刺獲得患者的骨髓標(biāo)本，此項(xiàng)檢測為有創(chuàng)檢測。血漿循環(huán)DNA檢測僅需要患者血液，為無創(chuàng)檢測。血漿DNA定量檢測具有取樣方便、無創(chuàng)、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)勢，可減少患者反復(fù)骨髓穿刺的創(chuàng)傷，方便臨床醫(yī)師對隨訪患者的病情進(jìn)展及療效進(jìn)行監(jiān)測［26］。

［1］ 夏文穎，丁倩倩，潘世揚(yáng)，等.血漿DNA定量檢測在晚期肺癌患者個體化治療中的應(yīng)用價值［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2010(3):185-187.

［2］ Van der Drift MA，Hol BE，Klaassen CH，et al.Circulating DNA is a non-invasive prognostic factor for survival in non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2010，68(2):283-287.

［3］ 龐智睿，潘世揚(yáng)，徐 建，等.血漿DNA甲基化檢測在宮頸疾病診斷中的應(yīng)用［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2012，(8):570-573.

［4］ 趙文君，潘世揚(yáng)，馬建鋒，等.食管癌患者血漿循環(huán)DNA定量檢測及臨床特征分析［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2009，(3):201-203.

［5］ Pan S，Xia W，Ding Q，et al.Can plasma DNA monitoring be employed in personalized chemotherapy for patients with advanced lung cancer?［J］Biomed Pharmacother，2012，66(2):131-137.

［6］ Tong W G，Wierda W G，Lin E，et al.Genome-wide DNA methylation profiling of chronic lymphocytic leukemia allows identification of epigenetically repressed molecular pathways with clinical impact［J］.Epigenetics，2010，5(6):499-508.

［7］ Rogers A，Joe Y，Manshouri T，et al.Relative increase in leukemia-specific DNA in peripheral blood plasma from patients with acute myeloid leukemia and myelodysplasia［J］.Blood，2004，103(7):2799-2801.

［8］ 張之南.血液病學(xué)［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，1997(12):10-11.

［9］ Wierda W G，O'Brien S，Wang X，et al.Prognostic nomogram and index for overall survival in previously untreated patients with chronic lymphocytic leukemia［J］.Blood，2007，109(11):4679-4685.

［10］ 陳 丹.人血液循環(huán)DNA的定量檢測研究［D］.南京醫(yī)科大學(xué)，2007.

［11］ Fleischhacker M，Schmidt B.Circulating nucleic acids(CNAs)and cancer——a survey［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1775(1):181-232.

［12］ Sonnenberg A，Marciniak JY，Skowronski EA，et al.Dielectrophoretic isolation and detection of cancer-related circulating cellfree DNA biomarkers from blood and plasma［J］.Electrophoresis，2014，35(12-13):1828-1836.

［13］ Sonnenberg A，Marciniak JY，Rassenti L，et al.Rapid electrokinetic isolation of cancer-related circulating cell-free DNA directly from blood［J］.Clin Chem，2014，60(3):500-509.

［14］ Kumar S，Guleria R，Singh V，et al.Efficacy of circulating plasma DNA as a diagnostic tool for advanced non-small cell lung cancer and its predictive utility for survival and response to chemotherapy［J］.Lung Cancer，2010，70(2):211-217.

［15］ Leon S A，Shapiro B，Sklaroff DM，et al.Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy［J］.Cancer Res，1977，37(3):646-650.

［16］ Stroun M，Anker P，Maurice P，et al.Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］.Oncology，1989，46(5):318-322.

［17］ 穆 原，潘世揚(yáng)，張石江，等.定量檢測血漿DNA水平評估非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的價值［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2009，(3):205-207.

［18］ 賴 靜，顧 軍，許 晶，等.p53在乳腺癌中的表達(dá)意義及5-氮雜脫氧胞苷對 p53的調(diào)控作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，(6):573-576.

［19］ 王 璇，王建東，羅春英，等.結(jié)直腸癌中K-ras基因突變的檢測及其臨床病理學(xué)意義［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(1):19-22.

［20］ Catarino R，F(xiàn)erreira MM，Rodrigues H，et al.Quantification of free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer［J］.DNA Cell Biol，2008，27(8):415-421.

［21］ Papadopoulou E，Davilas E，Sotiriou V，et al.Cell-free DNA and RNA in plasma as a new molecular marker for prostate and breast cancer［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1075:235-243.

［22］ Tomita H，Ichikawa D，Ikoma D，et al.Quantification of circulating plasma DNA fragments as tumor markers in patients with esophageal cancer［J］.Anticancer Res，2007，27(4C):2737-2741.

［23］ Stroun M，Anker P.Bacterial nucleic acid synthesis in plants following bacterial contact［J］.Mol Gen Genet，1971，113(1):92-98.

［24］ 張紅梅，潘世揚(yáng)，蔣 葉，等.血漿DNA定量用于監(jiān)測成人急性淋巴細(xì)胞白血病患者化療療效［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2012，(8):574-576.

［25］ 蔣 葉，潘世揚(yáng)，夏文穎，等.急性髓系白血病患者血漿循環(huán)DNA動態(tài)監(jiān)測及其臨床意義［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2012，(1):53-56.

［26］ 王 珺，馬學(xué)娟，鄭靈芝，等.小干擾RNA沉默白血病抑制因子基因?qū)φ纤卅力挺?表達(dá)的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(2):151-156.