高壓干燥保存對(duì)小鼠供心冷缺血再灌注損傷中自噬及凋亡作用的影響

張 瑞，黃 帥，富 旗，鄭少憶，郭惠明，陳寄梅，莊 建，朱 平

0 引 言

終末期心臟疾病最好的治療方法是心臟移植。臨床上應(yīng)用最多的心臟保存方式是單純低溫浸泡保存，最常用的浸泡液則是組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液(histidine-tryptophan-ketoglutarate solution，HTK)。但浸泡保存的安全缺血時(shí)間限制為5～6 h，超過(guò)這一時(shí)限，心肌可出現(xiàn)不可逆的損傷。心臟保存時(shí)間過(guò)短是供心缺乏的因素之一，限制了心臟移植手術(shù)的開(kāi)展。日本學(xué)者通過(guò)將大鼠心臟保存在高壓干燥環(huán)境中，在保證較高復(fù)跳率的前提下顯著延長(zhǎng)了供心保存時(shí)間［1］。但其研究?jī)H停留在現(xiàn)象觀察，未與其他保存方式進(jìn)行比較，也未進(jìn)行生物學(xué)方面的檢測(cè)。近些年國(guó)內(nèi)外對(duì)于干燥保存的進(jìn)一步研究幾近空白。本研究是在此基礎(chǔ)上，對(duì)供心高壓干燥保存與HTK液浸泡保存移植后的復(fù)跳率、移植后2 h供心活力評(píng)分、移植后24h凋亡指數(shù)、移植后24h自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1-輕鏈3-Ⅱ(microtubuleassociated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)及 B 細(xì)胞白血病/淋巴瘤-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)蛋白的表達(dá)進(jìn)行比較，觀察一氧化碳和氧氣混合氣體的高壓干燥保存方式是否優(yōu)于HTK液浸泡保存，并探討該保存方式的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠84只。供鼠4～6周齡，體重(21±2)g，共48只;受鼠6～8周齡，體重(29±2)g，共36只，所有實(shí)驗(yàn)用鼠均購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):No.44008500005103)，飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，并實(shí)行嚴(yán)格的微生物控制，同時(shí)保證屏障環(huán)境內(nèi)溫度控制在20℃ ～25℃，日溫差＜3℃，相對(duì)濕度50% ～70%。供鼠隨機(jī)分為4組(n=12):對(duì)照組、即刻移植供體組、HTK浸泡保存供體組及高壓干燥保存供體組。受鼠隨機(jī)分為3組(n=12):即刻移植受體組、HTK保存受體組及高壓干燥保存受體組。

1.2 供心切取方式及灌注保存方法 所有供鼠術(shù)前準(zhǔn)備及供心切取方式參見(jiàn)文獻(xiàn)［2-3］。切取供心后按照分組不同行相應(yīng)處理。對(duì)照組:供心取出后不做特殊處理直接送檢;即刻移植供體組:供心取出經(jīng)主動(dòng)脈插管予逆行灌注4℃等滲鹽水1 mL，不經(jīng)保存即刻移植;HTK保存供體組:供心取出后經(jīng)主動(dòng)脈套管逆行灌注，4℃ HTK液1 mL，浸泡于15 mL HTK液中，置于4℃冰箱保存24 h;高壓干燥保存供體組:供心經(jīng)主動(dòng)脈套管逆行灌注，4℃ 改良Krebs-Henseleit液1 mL(KH液)，KH液配方參見(jiàn)文獻(xiàn)［2］，懸掛于已預(yù)冷至4℃的干燥高壓保存罐內(nèi)(保存罐購(gòu)自于日本成育心血管病研究中心)，供心下方放裝有15 mL純凈水的燒杯，用以維持保存罐內(nèi)濕度。往罐內(nèi)注入800 hPa的一氧化碳及3200 hPa的氧氣，密封后將罐置于4℃冰箱中保存24 h。

1.3 供心異位移植術(shù) 受鼠按供鼠處理方法麻醉固定備皮消毒，在16倍雙人雙目手術(shù)顯微鏡下行頸部異位心臟移植手術(shù)。采用改良Cuff技術(shù)，將即刻移植供體組(供心未經(jīng)保存)、HTK保存供體組(供心HTK液浸泡保存24 h)、高壓干燥保存供體組(供心高壓干燥環(huán)境中保存24 h)的供心分別移植于即刻移植受體組、HTK保存受體組以及高壓干燥保存受體組小鼠頸部。利用動(dòng)靜脈套管(購(gòu)于日本成育心血管病研究中心)將受體右頸總動(dòng)脈、頸外靜脈分別與供心主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈吻合，吻合完畢后，開(kāi)放動(dòng)靜脈血管夾，恢復(fù)血流。術(shù)后觀察2 h，記錄即刻移植受體組、HTK保存受體組、高壓干燥保存受體組小鼠頸部異位移植后的供心復(fù)跳情況并行移植物功能評(píng)分參見(jiàn)文獻(xiàn)［2］。

1.4 移植術(shù)后處理 術(shù)畢，一次性肌內(nèi)注射青霉素5 U/g。受鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)、保暖。

1.5 檢測(cè)項(xiàng)目

1.5.1 自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ檢測(cè) 移植后24 h，取各組供心組織10 mg，勻漿，加入100 μL裂解液，冰上裂解30 min;4℃，2000 r/min，離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，取等量的標(biāo)本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印，封閉液封閉。加入抗稀釋好的 LC3一抗(1∶1000)4℃過(guò)夜，以心肌組織α-tubulin作內(nèi)參，洗膜后加入相應(yīng)羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫?fù)u動(dòng)孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色劑顯色。陽(yáng)性條帶以Gel pro32軟件分析，測(cè)其吸光度值(A值)。結(jié)果以陽(yáng)性條帶A值與α-tubulin A值的比值表示。LC3多抗購(gòu)自一科生物科技有限公司;全蛋白提取試劑盒購(gòu)于凱基生物公司。

1.5.2 Bcl-2凋亡蛋白檢測(cè) Bcl-2凋亡蛋白的檢測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［2］。

1.5.3 心肌病理組織學(xué)檢查 對(duì)照組直接取供心心尖部10 mm×10 mm×5 mm組織，即刻移植受體組、HTK保存受體組、高壓干燥保存受體組于移植后24 h取頸部異位移植供心心尖部10 mm×10 mm×5 mm組織，4%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

1.5.4 心肌凋亡細(xì)胞檢測(cè) 對(duì)照組直接取供心組織100 mg，即刻移植受體組、HTK保存受體組、高壓干燥保存受體組于移植后24 h取頸部異位移植供心組織100 mg，將心肌石蠟切片脫蠟脫水，采用TUNEL染色法染色，顯微鏡下觀察有綠色顆粒者即為凋亡的心肌細(xì)胞。在光鏡下，每組切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野(400倍)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞核及整個(gè)心肌細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算心肌細(xì)胞的平均凋亡指數(shù)。公式如下:

心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)=凋亡數(shù)目/心肌細(xì)胞總數(shù)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示?；盍υu(píng)分不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Kruskal-wallis H)進(jìn)行分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。LC3-Ⅱ、Bcl-2及凋亡指數(shù)結(jié)果采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用SNK法檢驗(yàn);如果方差不齊，則采用Tamhane'T2法進(jìn)行檢驗(yàn)。組間頻數(shù)比較采用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)跳率和移植物功能評(píng)分 即刻移植受體組、HTK保存受體組、高壓干燥保存受體組頸部異位移植供心再灌注后復(fù)跳率為 75.0%、8.3%、66.7%，HTK保存受體組供心復(fù)跳率顯著低于即刻移植受體組和高壓干燥保存受體組(P＜0.05)。

再灌注2 h后，高壓干燥保存受體組、HTK保存受體組、即刻移植受體組頸部異位移植供心移植物功能評(píng)分分別為［2.5(2.0 ～2.9)］、［4.5(4.0 ～4.5)］、［0.8(0.5 ～1.0)］分。高壓干燥保存受體組、HTK 保存受體組移植物功能評(píng)分較即刻移植受體組降低(P＜0.01)。高壓干燥保存受體組移植物功能評(píng)分高于HTK保存受體組(P＜0.01)。

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 高壓干燥保存受體組、即刻移植受體組LC3-Ⅱ蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組;高壓干燥保存受體組高于HTK保存受體組(P＜0.05)。HTK保存受體組Bcl-2蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組(P＜0.05)。高壓干燥保存受體組LC3-Ⅱ表達(dá)低于即刻移植受體組(P＜0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組小鼠LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白的表達(dá)(±s)Table 1 Expressions of LC3-Ⅱand Bcl-2 in different groups of mice(±s)

表1 各組小鼠LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白的表達(dá)(±s)Table 1 Expressions of LC3-Ⅱand Bcl-2 in different groups of mice(±s)

與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與即刻移植受體組比較，#P＜0.05;與HTK保存受體組比較，△P＜0.05

組別 n LC3-Ⅱ/α-tubulin Bcl-2/α-tubulin對(duì)照組12 0.13 ±0.03 0.19 ±0.02即刻移植受體組 12 1.24 ±0.20* 2.07±0.32*HTK 保存受體組 12 0.16 ±0.06# 0.26±0.08*#高壓干燥保存受體組 12 0.87±0.18*#△ 2.06±0.29＊△

圖1 LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Results of Western blot for the expressions of LC3-Ⅱand Bcl-2 in different groups of mice

2.3 HE染色及Tunnel染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)HE染色后，光鏡下對(duì)照組和即刻移植受體組心肌細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞無(wú)水腫，HTK保存受體組和高壓干燥保存受體組較對(duì)照組、即刻移植受體組可見(jiàn)心肌水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而高壓干燥保存受體組較HTK保存受體組病理?yè)p傷較輕。Tunnel染色后，光鏡下對(duì)照組心肌細(xì)胞呈均一的淡染，未見(jiàn)異常核。Tunnel標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，即刻移植組心肌細(xì)胞染色均勻，未見(jiàn)綠色陽(yáng)性細(xì)胞，HTK保存受體組可見(jiàn)大量綠色陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，明顯較高壓干燥保存受體組增加。對(duì)照組、即刻移植受體組、HTK保存受體組、高壓干燥保存受體組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(1.08±0.56)、(2.13 ± 1.71)、(26.72 ± 5.23)、(5.04 ± 1.77)%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與對(duì)照組、即刻移植受體組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，高壓干燥保存受體組、HTK保存受體組升高(P＜0.01);高壓干燥保存受體組凋亡指數(shù)較HTK保存受體組降低(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(×400)Figure 2 Myocardial histomorphology of different groups of mice(×400)

3 討 論

日本學(xué)者YoShida等［1］認(rèn)為組織或細(xì)胞的結(jié)構(gòu)未受損且其內(nèi)的結(jié)合水不受影響的情況下，游離水的減少可以降低新陳代謝率從而延長(zhǎng)組織保存時(shí)間?；诖?，他們進(jìn)行了一系列的高壓干燥保存研究，發(fā)現(xiàn)將大鼠供心懸掛暴露于(氧分壓:1600 hPa，一氧化碳分壓:400 hPa)高壓環(huán)境中保存24 h，移植后復(fù)跳率可達(dá)80%。本研究在日本學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，將小鼠供心懸掛于(氧分壓:3200 hPa，一氧化碳分壓:800 hPa)的高壓環(huán)境中保存24 h，并與臨床上常用的HTK液浸泡保存方法進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高壓干燥保存受體組復(fù)跳率為66.7%，低于日本學(xué)者80%的復(fù)跳率，但遠(yuǎn)高于HTK保存受體組(8.3%)。供心移植后2 h，高壓干燥保存受體組功能評(píng)分優(yōu)于HTK保存受體組，移植24h后供心HE染色心肌病理改變高壓干燥保存受體組較HTK保存受體組輕。這在一定程度上說(shuō)明了，在一氧化碳(一氧化碳分壓:800 hPa)和氧氣(氧分壓:3200 hPa)的高壓干燥環(huán)境中保存供心，能夠減少供心在冷缺血時(shí)的心肌細(xì)胞壞死，促進(jìn)移植再灌注后供心心臟功能的恢復(fù)。

自噬在心肌的缺血及再灌注過(guò)程中均發(fā)揮著一定作用［4］。在急性和慢性缺血狀態(tài)下自噬均可被啟動(dòng)，當(dāng)心肌細(xì)胞處于如缺血造成的營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，胞內(nèi)自噬體會(huì)明顯增加［5］，此時(shí)自噬通過(guò)清除無(wú)用細(xì)胞器和蛋白質(zhì)為細(xì)胞提供能量，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。此外自噬也有可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［5］，可能與損傷的線粒體被吞噬，減少了促凋亡物質(zhì)的釋放有關(guān)。在再灌注階段，自噬作用是增強(qiáng)的，該階段自噬的產(chǎn)生主要依賴于Beclin1的表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)心肌有害［6］。因過(guò)度的自噬會(huì)加重細(xì)胞損傷、促進(jìn)細(xì)胞死亡，且這種死亡方式不同于凋亡或壞死，稱為自噬性死亡或Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［7］。LC3-Ⅱ是自噬的標(biāo)記分子，可用以評(píng)價(jià)自噬強(qiáng)度。結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即刻移植受體組供心未經(jīng)保存，復(fù)灌后自噬較對(duì)照組升高，原因除了急性缺血狀態(tài)下自噬增加以外還考慮有復(fù)灌后再灌注階段自噬作用的進(jìn)一步增強(qiáng)。高壓干燥保存受體組與HTK保存受體組供心相比，自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，移植后供心功能的恢復(fù)及檢測(cè)指標(biāo)優(yōu)于HTK保存受體組，考慮在干燥保存狀態(tài)下保存供心，供心處在離體狀態(tài)，無(wú)血液灌注，在保存過(guò)程中自噬作用增強(qiáng)，通過(guò)清除無(wú)用細(xì)胞器為細(xì)胞提供能量，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一［8］，特定的基因調(diào)控細(xì)胞凋亡Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的基因之一。Bcl-2為抗凋亡蛋白［9-10］，是參與調(diào)控凋亡的關(guān)鍵因素，常被用作凋亡的檢測(cè)指標(biāo)［11］。本研究中由Tunnel染色結(jié)果推測(cè)即刻移植受體組供心在再灌注階段啟動(dòng)了抗凋亡作用有關(guān)。高壓干燥保存受體組的Bcl-2蛋白表達(dá)高于HTK保存受體組，這一結(jié)果與Tunnel染色結(jié)果相吻合。這些結(jié)果在一定程度上表明，心肌細(xì)胞的凋亡程度與心肌冷缺血再灌注損傷程度相關(guān)，高壓干燥保存有可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕供心冷缺血再灌注損傷。

根據(jù)本研究的凋亡檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)外源性一氧化碳在高壓干燥保存方法中發(fā)揮了重要作用。內(nèi)源性一氧化碳主要來(lái)源于血紅素氧合酶系統(tǒng)，HO-1將血紅素降解為一氧化碳、鐵和膽綠素［12］，內(nèi)源性一氧化碳具有重要的生理作用和增加機(jī)體抗損傷的作用，但是通過(guò)增加內(nèi)源性一氧化碳來(lái)達(dá)到減輕病理性變化的方法復(fù)雜，是非特異性、難以量化和調(diào)控的。近年來(lái)的研究表明，外源性一氧化碳也有具有抗炎癥［13］、抗氧化［14］及抗細(xì)胞凋亡［15］等作用。Akamatsu等［16］研究表明，取心前將供體小鼠放入一氧化碳濃度為400/100萬(wàn)的環(huán)境中，同時(shí)在保存過(guò)程中將供心浸泡在含有一氧化碳濃度為1%的UW液中，能明顯減少供心的冷缺血再灌注損傷，供心心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯減少［17-18］。但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，吸入的外源性一氧化碳可能會(huì)受到血紅蛋白的影響，多數(shù)與血紅蛋白結(jié)合，抑制了一氧化碳抗凋亡作用的發(fā)揮。與其他研究不同，本研究將供心直接暴露在富含一氧化碳的高壓干燥環(huán)境中，一氧化碳的調(diào)節(jié)作用直接作用于供心。本研究中Tunnel染色及Bcl-2蛋白檢測(cè)結(jié)果，也說(shuō)明了一氧化碳有抑制心肌細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)保存時(shí)間的效果。

綜上所述，本研究認(rèn)為高壓干燥(氧分壓:3200 hPa，一氧化碳分壓:800 hPa)的保存方式是一種有效的心臟保存方法，該保存方法可能利于冷缺血過(guò)程中自噬作用的發(fā)揮，通過(guò)清除無(wú)用的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)為心肌細(xì)胞提供能量，達(dá)到保護(hù)心肌的作用，此外，該保存方法利用高壓一氧化碳作用于心肌細(xì)胞，使心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白上調(diào)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，延長(zhǎng)了供心保存時(shí)間，但其機(jī)制仍值得進(jìn)一步探討。

［1］ Yoshida Y，Hatayama N，Seki K.Study on the preservation with CO(PCO=200-2，000 hPa)，resuscitation，and heterotopic transplantation of an isolated rat heart［J］.Cell Transplant，2009，18(5):535-540.

［2］ 黃 帥，趙明一，富 旗，等.高壓干燥保存對(duì)小鼠供心冷缺血再灌注損傷的影響［J］.嶺南心血管病雜志，2015，21(4):549-555.

［3］ 程 峰，顧曉冬，項(xiàng)建斌，等.改良Cuff技術(shù)建立小鼠頸部異位心臟移植模型［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，35(6):919-920.

［4］ Chen-Scarabelli C，Agrawal PR，Saravolatz L，et al.The role and modulation of autophagy in experimental models of myocardial ischemia-reperfusion injury［J］.J Geriatr Cardiol，2014，11(4):338-348.

［5］ Yan L，Sadoshima J，Vatner DE，et al.Autophagy in chronically ischemic myocardium［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(39):13807-13812.

［6］ Matsui Y，Takagi H，Qu X，et al.Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion:roles of AMP-activated protein kinase and Beclin 1 in mediating autophagy［J］.Circ Res，2007，100(6):914-922.

［7］ 顧 聞，何宋兵，汪 良，自噬相關(guān)基因與結(jié)腸癌的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014(4):414-417.

［8］ Guo J，Wang SB，Yuan TY，et al.Coptisine protects rat heart against myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing myocardial apoptosis and inflammation［J］.Atherosclerosis，2013，231(2):384-391.

［9］ Yin XM，Oltvai ZN，and Korsmeyer SJ.BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax［J］.Nature，1994，369(6478):321-323.

［10］ 葛賢秀，曹 鵬，盧悟廣，等.重組東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽抑制人膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用及其機(jī)制研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(4):343-347.

［11］ 葉 浩，張樹(shù)友.急性胰腺炎發(fā)病中腺泡細(xì)胞自噬與凋亡機(jī)制關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(3):321-325.

［12］ 丁 晶，李濟(jì)宇.血紅素加氧酶的生物學(xué)功能及其在肝移植中的作用研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21(12):1314-1317.

［13］ Wang X，Cao J，Sun BW，et al.Exogenous carbon monoxide attenuates inflammatory responses in the small intestine of septic mice［J］.World J Gastroenterol，2012，18(40):5719-5728.

［14］ Wen Z，Liu Y，Li F，et al.Low dose of carbon monoxide intraperitoneal injection provides potent protection against GalN/LPS-induced acute liver injury in mice［J］.J Appl Toxicol，2013，33(12):1424-1432.

［15］ Zhang X，Shan P，Otterbein LE，et al.Carbon monoxide inhibition of apoptosis during ischemia-reperfusion lung injury is dependent on the p38 mitogen-activated protein kinase pathway and involves caspase 3［J］.J Biol Chem，2003，278(2):1248-1258.

［16］ Akamatsu Y，Haga M，Tyagi S，et al.Heme oxygenase-1-derived carbon monoxide protects hearts from transplant associated ischemia reperfusion injury［J］.FASEB J，2004，18(6):771-772.

［17］ 曹桎銘，石 蓓.固有心臟干細(xì)胞與心肌再生的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(3):299-302.

［18］ 馬宏煒，馬永濤，李志超.高氧液研究新進(jìn)展及其應(yīng)用前景［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(7):757-761.