星突江鰈胰島素樣生長(zhǎng)因子I的體外重組表達(dá)及生物活性分析

徐永江，臧 坤，2，柳學(xué)周，史 寶，陳圣毅，2

（1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

星突江鰈胰島素樣生長(zhǎng)因子I的體外重組表達(dá)及生物活性分析

徐永江1，臧 坤1，2，柳學(xué)周1，史 寶1，陳圣毅1，2

（1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

為了在蛋白水平認(rèn)識(shí)星突江鰈（Platichthys stellatus）胰島素樣生長(zhǎng)因子I（IGF-I）的生長(zhǎng)調(diào)控作用及機(jī)制，采用RT-PCR方法擴(kuò)增了其成熟肽片段，利用原核表達(dá)載體pET-28a成功構(gòu)建了重組星突江鰈IGFI/pET-28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了N端含6個(gè)組氨酸的重組星突江鰈IGFI蛋白。獲得的重組IGF-I蛋白大小為12.1 kD，37℃下用0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)3 h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的39.8%，主要以包涵體形式存在。Western blotting免疫印跡表明星突江鰈IGF-I重組蛋白均可被6×His抗體特異性識(shí)別。包涵體經(jīng)6 mol/L鹽酸胍變性、Ni2+離子親和柱純化和尿素梯度復(fù)性后，可獲得高純度的IGF-I重組蛋白。細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示0.6 μg/mL的星突江鰈IGF-I重組蛋白能顯著促進(jìn)人胚胎腎細(xì)胞HEK293T的增殖而大于1.8 μg/mL時(shí)則表現(xiàn)出抑制作用。本研究成功構(gòu)建了星突江鰈IGF-I體外高效表達(dá)系統(tǒng)，并獲得具有細(xì)胞水平生物活性的星突江鰈IGF-I重組蛋白，結(jié)果可為深入探究IGF-I在星突江鰈生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制及研制高效綠色的促生長(zhǎng)制劑提供基礎(chǔ)資料。

星突江鰈；胰島素樣生長(zhǎng)因子I；原核表達(dá)；生物活性

1 前言

魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素-胰島素樣生長(zhǎng)因子（GH-IGFs）軸在生長(zhǎng)調(diào)控中起著非常重要的生理作用。IGF-I是重要的GH下游調(diào)控因子，注射GH可顯著提高魚(yú)類(lèi)肝臟中IGF-ImRNA表達(dá)量和血漿IGF-I濃度[1，2]。血漿IGF-I濃度與魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)速度表現(xiàn)出較高相關(guān)性，Picha等[3]已將其作為指示魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的指標(biāo)之一。此外，IGF-I在魚(yú)類(lèi)生殖[4]、早期發(fā)育[5，6]、免疫應(yīng)答[7]和滲透壓調(diào)節(jié)[8]等方面均發(fā)揮重要作用。目前，研究人員在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了鱸魚(yú)[9]、羅非魚(yú)（Oreochromis Niloticus）[10]、草魚(yú)[11]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[12]和大菱鲆（Scophthalmus maximus）[13]等 IGF-I的體外重組表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞增殖誘導(dǎo)試驗(yàn)證明了所獲得IGF-I重組蛋白的生物活性。近期Li等[14]首次在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了斜帶石斑魚(yú)IGF-I的重組蛋白表達(dá)，為魚(yú)類(lèi)IGF-I進(jìn)一步在養(yǎng)殖中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

星突江鰈（Platichthys stellatus）屬鰈形目（Pleuronectiformes）、鰈科（Pleuronectidae）、江鰈屬（Platichthys），分布于我國(guó)、日本、俄羅斯、加拿大及美國(guó)太平洋沿岸，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鲆鰈類(lèi)魚(yú)種，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、廣溫廣鹽、耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)，在東亞地區(qū)深受消費(fèi)者喜愛(ài)[15]。近年來(lái)，我國(guó)突破了星突江鰈的人工繁育技術(shù)[16]，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)正在逐步興起。本研究利用原核表達(dá)載體構(gòu)建了星突江鰈IGF-I成熟肽重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了IGF-I重組蛋白的體外高效表達(dá)，并分析了重組psIGF-I蛋白生物活性，以期為深入解析IGF-I在星突江鰈生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用機(jī)制和綠色高效促生長(zhǎng)制劑的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試驗(yàn)用魚(yú)

星突江鰈雌魚(yú)3尾（體長(zhǎng)32～35 cm、體重1 014～1 025 g）取自日照市海洋水產(chǎn)資源增殖站，以MS-222（280 mg/L）麻醉處死，迅速取其垂體和肝臟組織于液氮中（-196℃）速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存，用于總RNA提取。

2.2 RNA提取和cDNA第一鏈的合成

利用RNAiso Plus（TaKaRa）提取星突江鰈垂體和肝臟總RNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，使用微量核酸測(cè)定儀（Nanodrop ND2000）檢測(cè)濃度。利用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

2.3 IGF-I/pET-28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)星突江鰈IGF-I的cDNA序列（GenBank序列號(hào)KC709503），參照pET-28a載體（Invitrogen）上的多克隆位點(diǎn)排列特點(diǎn)，選取BamH I和Hind III作為酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物GAAATGGCCTCGGCGGAG-3′和 IGF-IR：5′-TAATTCGGACTTGGCGGGTTTG-3′擴(kuò)增IGF-I成熟肽片段。在上游引物IGF-IF的5′端分別加入了酶切位點(diǎn)BamH I（方框標(biāo)注），在下游引物IGF-IR的5′端中加入酶切位點(diǎn)Hind III（方框標(biāo)注）和強(qiáng)終止密碼子TAA（單下劃線標(biāo)注）。IGF-I成熟肽的PCR擴(kuò)增使用肝臟cDNA為模板，PCR條件：94℃變性5 min；94℃30 s、61℃30 s、72℃50 s；34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將擴(kuò)增得到的成熟肽片段連接到pEASY-T1 Simple載體（TransGen）上，挑選陽(yáng)性克隆送往上海生工公司測(cè)序驗(yàn)證。

利用質(zhì)粒小提試劑盒（TaKaRa）提取IGF-I/ pEASY-T1質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III（TaKaRa）將IGF-I/pEASY-T1質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a雙酶切，使用T4連接酶（TaKaRa）將雙酶切后的目的片段連接到pET-28a上，得到重組質(zhì)粒IGF-I/ pET-28a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α（Invitrogen）中，菌液PCR驗(yàn)證后并測(cè)序。

2.4 重組IGF-I/pET-28a質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21（Invitrogen），挑取陽(yáng)性單克隆接種于含Kana（100 μg/mL）的5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.7，加入IPTG（1 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h和8 h時(shí)各取1 mL菌液，8 000 r/min 10 min離心收集菌體，PBS洗滌并重懸菌體，SDS-PAGE（15%分離膠）電泳檢測(cè)，Sigma Scan Pro 5軟件分析蛋白表達(dá)率。

菌液分別在21℃、29℃、37℃、45℃條件下IPTG（1 mmol/L）誘導(dǎo)6 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，研究不同溫度下蛋白表達(dá)的差異。

菌液在37℃條件下培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.7時(shí)，加入IPTG使其終濃度分別為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、5.0 mmol/L誘導(dǎo)6h取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，研究不同IPTG濃度對(duì)重組載體蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用。

2.5 重組IGF-I蛋白western-blotting驗(yàn)證

分別收集誘導(dǎo)6h的重組GH和重組IGF-I菌體沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳后，利用半干電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并用5%BSA封閉，以鼠抗6×HisMonoclonal Antibody（TransGen）為一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（TransGen）為二抗，4℃下分別孵育過(guò)夜，使用HRP-DAB顯色試劑（Solarbio）進(jìn)行顯色。

2.6 重組IGF-I蛋白純化和復(fù)性

GH重組菌37℃條件下IPTG（1 mmol/L）誘導(dǎo)6 h，IGF-I重組菌37℃條件下IPTG（0.5 mmol/L）誘導(dǎo)3 h后，8 000 r/min 4℃離心10 min，PBS洗滌沉淀，用1/10體積的超聲波破碎液（50 mmol/LTris-HCl pH 8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA）重懸菌體，重懸后的菌液于冰浴中進(jìn)行超聲破碎，SDSPAGE檢測(cè)沉淀和上清。破碎后的沉淀用包涵體洗滌液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、2 mol/L Urea、1%Triton X-100）洗滌2～3次，洗滌后的包涵體溶于裂解液（6 mol/L guanidine HCl pH6.5、0.4 mol/L NaH2PO4、0.4 mol/L Na2HPO4、0.5 mol/L NaCl）4℃攪動(dòng)過(guò)夜變性，12 000 r/min離心10 min取上清，用0.8 μm和0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，Ni2+-NTA親和層析柱（TaKaRa）分離純化融合蛋白。

分離后的融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)后裝入到透析袋中，分別用8 mol/L尿素梯度復(fù)性液（50 mmol/L Tris-HCl pH6.5、0.2 mol/L NaH2PO4、0.2 mol/L Na2HPO4、0.05 mol/L NaCl、8 mol/L Urea、1%Glycine、10%Glycerol、1 mmol/LEDTA）、6 mol/L尿素梯度復(fù)性液（50 mmol/L Tris-HCl pH6.5、0.2 mol/L Na2HPO4、0.2 mol/L NaH2PO4、0.05 mol/L NaCl、6 mol/L Urea、10%Glycerol、1 mmol/L EDTA）、6 mol/L尿素梯度復(fù)性液（50 mmol/L Tris-HClpH 6.5、0.2 mol/L Na2HPO4、0.2 mol/L NaH2PO4、0.05 mol/L NaCl、4 mol/L Urea、10% Glycerol、1 mmol/L EDTA）、2 mol/L尿素梯度復(fù)性液（50 mmol/L Tris-HCl pH6.5、0.2 mol/L Na2HPO4、0.2 mol/L NaH2PO4、0.05 mol/L NaCl、2 mol/L Urea、1 mmol/L EDTA）和PBS充分透析復(fù)性，用3 kD超濾管（millipore）進(jìn)行超濾濃縮，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，-80℃超低溫冰箱保存。

2.7 重組GH和IGF-I蛋白生物活性檢測(cè)

利用BCA蛋白定量試劑盒（Thermo）檢測(cè)純化復(fù)性后的重組蛋白濃度，0.22 μm過(guò)濾除菌，用于檢測(cè)重組GH和IGF-I蛋白在終濃度分別為0.2 μg/mL、0.6 μg/mL、1.8 μg/mL、5.4 μg/mL、16.2 μg/mL、48.6 μg/mL時(shí)對(duì)人胚胎腎細(xì)胞HEK293T的增殖作用。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人胚胎腎細(xì)胞HEK293T以1×105/mL密度接種于96孔板（每孔200 μL），培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入含不同濃度重組蛋白的新鮮培養(yǎng)基，并設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)平行。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄上清，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT（Sigma）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）搖床低速震蕩10 min，酶標(biāo)檢測(cè)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度。

細(xì)胞增殖率（GSR）計(jì)算方法為：GSR（control）=Asample/Acontrol×100%，Asample為加入重組蛋白組，Acontrol為未加重組蛋白組。GSR數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±S.D.）來(lái)表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)視為差異顯著，當(dāng)P＜0.01時(shí)視為差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 IGF-I/pET-28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將正確克隆的IGF-I成熟肽序列插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a上，得到重組質(zhì)粒IGF-I/pET-28a，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，菌液PCR得到與預(yù)期大小相符的特異條帶（見(jiàn)圖1）。

圖1 IGF-I重組表達(dá)菌BL21的菌液PCR鑒定Fig.1 PCR verification of IGF-I recombinant plasmidin.E.coli BL21 cells

測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒GH/pET-28a和IGF-I/ pET-28a構(gòu)建成功。IGF-I/pET-28a重組質(zhì)粒（見(jiàn)圖2）在大腸桿菌中將表達(dá)包含103個(gè)氨基酸的重組蛋白，分子量為12.1 kD，等電點(diǎn)為8.527。重組蛋白N端均含有6×His標(biāo)簽，可進(jìn)行鑒定和蛋白純化。

圖2 星突江鰈IGF-I重組成熟肽序列Fig.2 The matured peptide sequence of IGF-I of Platichthys stellatus

3.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒IGF-I/pET-28a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的IGF-I重組菌在10 kD和15 kD之間出現(xiàn)特異性條帶，IGF-I重組蛋白大小為12.1 kD。SigmaScan pro 5軟件分析顯示，不同誘導(dǎo)條件下的重組菌蛋白表達(dá)量各不同，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和IPTG誘導(dǎo)濃度條件的優(yōu)化，得到重組IGF-I表達(dá)的最優(yōu)條件為37℃、IPTG（0.5 mmol/L）誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，重組蛋白表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的39.8%（見(jiàn)圖3～圖5）。

圖3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)星突江鰈重組IGF-I蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of induction time on production of Platichthys stellatus recombinant IGF-I protein

3.3 IGF-I重組蛋白的western-blotting驗(yàn)證

采用western-blotting免疫印跡方法對(duì)37℃下0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3 h的IGF-I重組菌分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示IGF-I重組菌則在PVDF膜上出現(xiàn)12.1 kD的單一印跡（見(jiàn)圖6），說(shuō)明重組菌表達(dá)的目的蛋白能被6×His抗體特異性識(shí)別，具有抗原活性，表明星突江鰈IGF-I重組蛋白分別表達(dá)成功。

3.4 IGF-I/pET-28a重組蛋白的純化

取37℃下0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3 h的重組IGF-I表達(dá)菌，超聲波破碎后的菌液沉淀和上清，0.45 μm濾膜過(guò)濾后的蛋白液以及Ni2+-NTA親和層析柱分離出的蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示重組菌所表達(dá)的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，通過(guò)Ni2+-NTA親和層析柱可對(duì)重組蛋白進(jìn)行有效的分離純化，純化的IGF-I重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為12.1 kD（見(jiàn)圖7），與預(yù)期大小相符合。

圖4 溫度對(duì)星突江鰈重組IGF-I蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of temperature on production of Platichthys stellatus recombinant IGF-I protein

圖5 IPGT濃度對(duì)星突江鰈重組IGF-I蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of IPTG concentrations on production of Platichthys stellatus recombinant IGF-I protein

3.5 重組蛋白的生物活性檢測(cè)

利用MTT法檢測(cè)不同濃度的重組星突江鰈IGF-I蛋白對(duì)人胚胎腎細(xì)胞HEK293T增殖的影響。重組星突江鰈IGF-I蛋白在0.6 μg/mL時(shí)能顯著促進(jìn)人胚胎腎細(xì)胞HEK293T增殖（P＜0.05），但濃度大于1.8 μg/mL時(shí)細(xì)胞的增殖速度卻顯著減慢（P＜0.05），濃度為16.8 μg/mL時(shí)這種抑制效應(yīng)更為明顯（P＜0.01，見(jiàn)圖8）。

圖6 星突江鰈重組IGF-I蛋白的western-blotting檢測(cè)Fig.6 Western-blotting analysis of Platichthys stellatus recombinant IGF-I protein

圖7 星突江鰈重組IGF-I蛋白的純化Fig.7 Purification of Platichthys stellatus recombinant IGF-I protein

圖8 重組星突江鰈IGF-I蛋白對(duì)人胚胎腎細(xì)胞HEK293T增殖速率的影響Fig.8 Effects of recombinant IGF-I protein fromPlatichthys stellatus on the proliferation of human embryo kidney cell HEK293T

4 討論

本研究利用體外重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了星突江鰈IGF-I成熟肽在大腸桿菌中的表達(dá)，并純化獲得了具有細(xì)胞水平生物活性的IGF-I重組蛋白。由于IGF-I成熟肽在硬骨魚(yú)類(lèi)中高度保守[1]，使得本研究結(jié)果不僅可以為星突江鰈IGF-I生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料，也可為其他魚(yú)類(lèi)的IGF-I生理功能及調(diào)控機(jī)制研究提供借鑒。

本研究選用帶有His標(biāo)簽的pET-28a載體作為星突江鰈IGF-I的重組表達(dá)載體，對(duì)于重組蛋白的Ni2+-NTA親和層析和western-blotting驗(yàn)證具有重要作用，并且已有報(bào)道證實(shí)重組蛋白添加的組氨酸末端不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白生物活性產(chǎn)生影響[17，18]。此外，PET載體被認(rèn)為是目前大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的強(qiáng)大系統(tǒng)，其基礎(chǔ)表達(dá)水平較低，利于實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的表達(dá)量還受到重組蛋白分子量、重組菌濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度等因素的影響[19]，本研究中37℃作為大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的最適宜溫度與其他原核表達(dá)研究中相一致[20，21]；最適宜的IPTG濃度也處于普遍報(bào)道使用的0.1～1.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)；增加誘導(dǎo)時(shí)間并沒(méi)有提高表達(dá)量，這可能因?yàn)樗拗骶鞍酌噶侩S著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加導(dǎo)致表達(dá)蛋白產(chǎn)生降解作用[20]。

IGF-I成熟肽中包含的6個(gè)半胱氨酸形成3對(duì)二硫鍵，二硫鍵對(duì)于穩(wěn)定蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)具有重要作用，原核表達(dá)系統(tǒng)中由于缺少真核蛋白修飾體系導(dǎo)致二硫鍵易發(fā)生錯(cuò)配而形成包涵體[13]。重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)優(yōu)點(diǎn)穩(wěn)定性高且具有較高的產(chǎn)量[22]，并且可避免被宿主菌中的蛋白酶降解[10]。但缺點(diǎn)是后續(xù)需要通過(guò)合理的變性和復(fù)性過(guò)程以獲得具有生物活性的重組目的蛋白，本研究使用6 mol/L鹽酸胍溶解包涵體對(duì)其錯(cuò)配的二硫鍵進(jìn)行變性[12]，并利用尿素梯度復(fù)性的方法[23]成功獲得了具有細(xì)胞水平生物活性的IGF-I重組蛋白。

先前報(bào)道表明重組虹鱒IGF-I能明顯促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞的增殖[24]，重組羅非魚(yú)IGF-Ⅱ則可促進(jìn)小鼠胚胎細(xì)胞和人類(lèi)肺組織細(xì)胞生長(zhǎng)[25]。本研究利用人胚胎腎細(xì)胞HEK293T檢測(cè)重組星突江鰈IGF-I的生物學(xué)活性。MTT法檢測(cè)顯示重組IGF-I蛋白在0.6 μg/mL能夠顯著促進(jìn)HEK293T細(xì)胞增殖，而在濃度大于1.8 μg/mL時(shí)出現(xiàn)抑制作用，表明本研究獲得的IGF-I重組蛋白具有細(xì)胞水平的生物活性。曹詣斌等[26]報(bào)道裸鯉（Gymnocy prisprzewalskii）重組IGF-Ⅱ蛋白能促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435生長(zhǎng)，但超過(guò)一定濃度可能起抑制作用，F(xiàn)u等[27]研究也表明IGFs既能促進(jìn)部分細(xì)胞增殖又能誘導(dǎo)其凋亡。下一步，將在生產(chǎn)水平上驗(yàn)證重組星圖江鰈IGF-I蛋白對(duì)養(yǎng)殖星圖江鰈生長(zhǎng)的調(diào)控作用。綜上，本研究利用原核表達(dá)載體構(gòu)建了星突江鰈IGF-I體外重組表達(dá)體系，獲得了具有細(xì)胞水平生物活性的體外重組IGF-I蛋白，為星突江鰈及其他魚(yú)種的IGF-I功能及機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為綠色高效促生長(zhǎng)劑的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)資料和技術(shù)支持。

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Prokaryotic expression and bioactivity analysis of growth hormone and insulin-like growth factor-I from Platichthys stellatus

Xu Yongjiang1，Zang Kun1，2，Liu Xuezhou1，Shi Bao1，Chen Shengyi1，2
（1.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao，Shandong 266071，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The mature peptide domain of insulin-like growth factor-I from Platichthys stellatus were amplified with specific primers based on its cDNA sequence.Then the matured peptide fragment was subcloned into the prokaryotic expression vector pET-28a to successfully construct IGF-I/pET-28a recombinant plasmid which were highly expressed in E.coli BL21（DE3）after being induced by IPTG with special fusion polypeptides containing His6 at their N-terminus.The obtained IGF-I polypeptide expressed in form of inclusion bodies with molecular weight of 12.1 kD and maximally accounted for 39.8%of the whole bacterial protein post 3 h induction with 0.5 mmol/L IPTG at 37℃.Western blotting analysis indicated fusion polypeptides had the antigenicity to His6 antibody.The inclusion bodies were denaturalized using 6 mol/L guanidine HCl，purified using Ni-NTA affinity chromatography and annealed by gradient dialysis in urea，then purified proteins with molecular weight of 12.1 kD which was obtained from IGF-I recombinant bacterium.The proliferation experiment showed recombinant IGF-I protein could significantly promote the proliferation of human embryonic kidney cells HEK293T at 0.6 μg/mL and inhibit the proliferation with 1.8 μg/mL which verified its biological activity. Therefore，the IGF-I prokaryotic expression system was successfully constructed in the present study and biologically active IGF-I fusion protein was obtained.The present results would be helpful for better understanding the roles of IGF-I in growth regulation and development of high effective additive for growth promotion of Platichthys stellatus.

Platichthys stellatus；insulin-like growth factor-I；prokaryotic expression；bioactivity

S96

A

1009-1742（2015）01-0067-07

2014-06-20

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA10A413）；鲆鰈類(lèi)現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-50）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2012CQ025）

徐永江，1981年出生，男，山東濟(jì)南市人，副研究員，主要從事海水魚(yú)類(lèi)繁育理論與增養(yǎng)殖技術(shù)研究工作；E-mail：xuyj@ysfri.ac.cn