綠色木霉菌種制備工藝優(yōu)化與工業(yè)化制備考察

李寶成，滿麗萍，果 然，李延鋒，馮卓彥

（1.湖北中化東方肥料有限公司，武漢430213，2.中化化肥有限公司，北京100031）

目前以農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展為宗旨的植物病蟲害生物防治，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著越來越重要的作用。綠色木霉菌(Trichoderma viride)是一類具有重要經(jīng)濟意義的生防有益菌，對多種引發(fā)土傳病害的病原菌具有抑制作用，其作用機制已得到廣泛深入的研究和報道，但是對其規(guī)?；a(chǎn)的應(yīng)用技術(shù)相關(guān)報道較少。目前生產(chǎn)的木霉菌劑多為分生孢子制劑，通常采用固體發(fā)酵或液、固兩相發(fā)酵生產(chǎn)，孢子產(chǎn)量被作為衡量發(fā)酵優(yōu)劣的核心指標。固態(tài)發(fā)酵是獲得大量真菌孢子的最好方法，通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的孢子質(zhì)量較高。孢子在干燥或紫外照射等環(huán)境下的抵抗性更強，貯存后孢子的存活率較高，并且發(fā)酵產(chǎn)品干燥后可直接制備成菌劑，工藝流程短，工藝環(huán)節(jié)少，生產(chǎn)成本更低，產(chǎn)品質(zhì)量更可靠[1]。在實際生產(chǎn)過程中綠色木霉生產(chǎn)比較繁瑣，特別是在液、固兩相發(fā)酵的生產(chǎn)過程中，通常是通過2%～3%液體種子或大量的克氏瓶斜面種子接種液體發(fā)酵罐后，接種固體培養(yǎng)基進行固體發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉制劑。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌株：經(jīng)華中農(nóng)業(yè)大學生命科學院鑒定為綠色木霉 （Trichoderma viride）。PDA培養(yǎng)基[2](g/L)：200g馬鈴薯、20g葡萄糖、23g瓊脂。121℃滅菌30min，備用。液體培養(yǎng)基 （g/L）：湖北中化東方肥料有限公司。固體培養(yǎng)基 （g/L）：湖北中化東方肥料有限公司。

1.2 實驗儀器

DT2000A型電子天平 （江蘇省常熟市意歐儀器儀表有限公司）；高壓滅菌鍋 （上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX-50KBS型）；單人凈化工作臺 （北京利康達科技發(fā)展有限公司，SW-CJ-1D型）；恒溫培養(yǎng)箱 （上海索譜儀器有限公司，PCE-3000型）；顯微鏡 （重慶市奧普光學儀器有限公司，UB100i）；

恒溫振蕩器 （國華電器有限公司，BS-4G）；離心機（上海安亭科學儀器廠，TDL-40D）；

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將PDA培養(yǎng)基均勻分裝在試管中，于121℃滅菌30min，冷卻至室溫，擺置成斜面，在超凈工作臺上無菌操作接4℃保藏的綠色木霉菌種，29℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)

使用250ml量筒將200ml液體培養(yǎng)基分裝入500ml三角瓶中，于121℃滅菌30min，冷卻至室溫后接入活化菌種，置于恒溫振蕩器中29℃180r/min下培養(yǎng)。

1.3.3 孢子制備

將PDA培養(yǎng)基分裝約70ml/250ml克氏瓶中，于121℃滅菌30min，冷卻至室溫，在超凈工作臺上無菌操作接種后，置于29℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7天，用刮下斜面孢子使用無菌水制成孢子懸液，經(jīng)實驗室血球計數(shù)檢測結(jié)果為：平均每個克氏瓶的孢子總數(shù)約為150億個。

大強度運動時相當于最大吸氧量的70%-80%（即70%-80%VO2max），運動時的心率約為125-165次/min，中等強度運動相當于最大吸氧量的50%-60%，運動時的心率約為110-135次/min，小強度運動相當于最大吸氧量的40%以下，運動時的心率約為100-110次/min。在實踐中，大學生應(yīng)根據(jù)自己的身體狀況及亞健康程度來選擇適宜的運動強度，一般可選擇中等強度運動。

1.3.4 根據(jù)正交表設(shè)計的4種固體培養(yǎng)基

麩皮、海藻活性粉、玉米粉、稻殼組分稱量并攪拌均勻，定量裝入500ml三角瓶中，于121℃滅菌1h，按10%的接種量接入搖床培養(yǎng)24h的液體種子，置于恒溫培養(yǎng)箱中29℃靜置培養(yǎng)，每日翻動一次三角瓶，發(fā)酵5天后取出，干燥后測定孢子數(shù)量。

1.3.5 三角瓶搖床實驗驗證，液體培養(yǎng)基200ml經(jīng)250ml量筒分裝500ml三角瓶中，于121℃ 滅菌30min，根據(jù)各處理的接種量接種發(fā)酵。處理1（對照）液體種子接種量0.015%；處理2正常液體接種量2%；處理3正常固體克氏瓶斜面種子12個；處理4固體孢子接種量0.015%。

于29℃180r/min搖床上培養(yǎng)。離心機4000r/min，5min離心去上清液，萬分之一天平精確稱量，按不同發(fā)酵周期檢測單位體積的菌絲體濕重。

1.3.6 車間液體發(fā)酵罐發(fā)酵驗證，數(shù)據(jù)詳見2.3.3表4。

2 結(jié)果和分析

2.1 固體培養(yǎng)基配方選擇

提培養(yǎng)基以麩皮為氮源發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳有機氮源，玉米粉與麩皮的水平比例為1:1[3-6]，另外添加硫酸鎂、碳酸鈣0.8%，pH值自然。本實驗以原有固體培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，通過正交設(shè)計優(yōu)化固體培養(yǎng)基組分麩皮、玉米粉、細稻殼、玉米漿的含量，選擇最佳含量。

表1 因素水平 %

通過正交設(shè)計實驗設(shè)計結(jié)果如表2。

試驗目的找出試驗結(jié)果因素影響的主次順序，從表2的極差R的大小順序排除的因素的主次順序為：

最優(yōu)化培養(yǎng)基組分為：A3B2C1D3和A3B3C1D3，根據(jù)原料成本優(yōu)先選擇A3B2C1D3作為生產(chǎn)配方。

表2 正交設(shè)計L9（34）

2.2 正交實驗數(shù)據(jù)結(jié)果方差分析

方差來源F=SS fjf A 9.76 2 4.88 20.77 顯著B 0.88 2 0.44 1.87 不顯著C 25.15 2 12.58 53.51 顯著D 0.47 2 0.24 1 不顯著

查表F0.05(2，2)=19.00F0.01(2，2)=99.00，故因素C、A作用顯著，因素B、D作用不顯著，與前面極差分析結(jié)果一致。

表3 同發(fā)酵周期取樣菌絲體含量檢測結(jié)果

2.3 實驗驗證

2.3.1 搖瓶實驗，通過200ml/500ml三角瓶搖瓶培養(yǎng)后同發(fā)酵周期取樣菌絲體含量檢測結(jié)果，見表3。

2.3.2 三角瓶搖瓶小試實驗，根據(jù)不同發(fā)酵周期檢測菌絲體濕重 （g/40ml），見圖1。

圖1 不同發(fā)酵周期

2.3.3 優(yōu)化菌種工藝通過100L發(fā)酵罐發(fā)酵驗證，與原工藝發(fā)酵周期菌絲體含量檢測對比結(jié)果，見表4。

表4 與原工藝發(fā)酵周期菌絲體含量檢測對比

3 結(jié)論

實驗通過正交實驗固體發(fā)酵制種提高單位物質(zhì)的孢子數(shù)量，優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基組分為：小米35%，玉米粉25%，玉米漿10%，麩皮30%，分生孢子的最大產(chǎn)量可達到7.7x109個/g（干培養(yǎng)物）。且該實驗優(yōu)化后的工藝縮短了菌種員在生產(chǎn)菌種制備、菌種純度驗證時間和工作量，制種、驗證和接種時間由原來的2h減少至25min，并且有效控制了生產(chǎn)菌種的生長同步性，使得種子罐發(fā)酵時綠色木霉孢子的萌發(fā)時間統(tǒng)一、菌絲體對數(shù)生長期基本一致，同時盡可能的降低染菌幾率。通過液體搖瓶驗證菌絲體含量明顯提升，特別是車間100L的液體發(fā)酵罐中試生產(chǎn)應(yīng)用數(shù)據(jù)表明，將接種量由原來的液體菌種2%或克氏瓶斜面種子12個，改進為現(xiàn)在固體菌種接種量為0.015%后，液體發(fā)酵在發(fā)酵周期30h時的菌絲體含量較原工藝同時期的菌絲體含量提升了1.25倍。該優(yōu)化后的工藝可大幅度提高綠色木霉菌工業(yè)化生產(chǎn)的效率。

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