球囊霉素相關(guān)土壤蛋白提取條件的優(yōu)化

何開(kāi)平，杜鵬，吳強(qiáng)盛 （長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025）

球囊霉素 （glomalin）是叢枝菌根真菌 （arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）侵染植物根系后由根外菌絲或孢子釋放的一類特殊糖蛋白，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的功能［1］。目前，對(duì)土壤中球囊霉素的測(cè)定主要是通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法和叢枝菌根真菌單克隆抗體MAb32B11進(jìn)行酶聯(lián)免疫 （ELISA）反應(yīng)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定球囊霉素時(shí)，高溫提取并不能破壞除球囊霉素以外的所有非熱穩(wěn)態(tài)土壤蛋白。因此，Rillig［2］建議使用球囊霉素相關(guān)土壤蛋白 （glomalin－related soil protein，GRSP）這個(gè)術(shù)語(yǔ)代替球囊霉素。AMF菌絲釋放的GRSP進(jìn)入土壤后，具有膠結(jié)功能，可與沙土、黏土以及有機(jī)物質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)團(tuán)聚體的形成和穩(wěn)定團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)，且這種功能要明顯高于根系菌根侵染率和土壤菌絲對(duì)團(tuán)聚體穩(wěn)定的效應(yīng)［3，4］。GRSP也能延緩?fù)寥乐刑嫉慕到猓?］，能夠固持重金屬污染的土壤中的重金屬［6］，調(diào)節(jié)土壤／植物中的水分狀況［7］。

Wu等［4］最近將GRSP分為2種類型，易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白 （EE－GRSP）和難提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白 （DE－GRSP），但是這2種物質(zhì)的提取技術(shù)還待商榷，一些提取的過(guò)程都不同程度地影響著EE－GRSP和DE－GRSP提取量。柑橘是我國(guó)南方重要的果樹(shù)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)民增收中具有重要作用。許多研究工作已經(jīng)證實(shí)GRSP對(duì)柑橘園土壤的團(tuán)聚體穩(wěn)定性和土壤肥力產(chǎn)生效應(yīng)［4，7］。

鑒于此，本研究擬對(duì)柑橘園土壤中EE－GRSP和DE－GRSP的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，為今后進(jìn)一步研究GRSP在柑橘園土壤中的作用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2013年4月21日，在長(zhǎng)江大學(xué)柑橘園26年生枳砧溫州蜜柑根圍收集土樣。隨機(jī)選擇8棵生長(zhǎng)健壯的植株，在距離植株根莖大約1m處，于表層5cm深處取土樣，每棵樹(shù)取土約1kg，帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，過(guò)4mm篩備用。

1.2 試驗(yàn)方法

EE－GRSP的提取參考文獻(xiàn) ［1］從3個(gè)不同因素考慮：土樣重量、高溫滅菌時(shí)間和離心時(shí)間。在試驗(yàn)過(guò)程中分別選取上一次最優(yōu)的試驗(yàn)結(jié)果作為下一次的提取條件。

土樣重量：稱取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25g的過(guò)篩土樣，按照常規(guī)提取比例（1∶8）分別加入2、4、6、8、10mL 20mmol／L檸檬酸緩沖液 （pH 7.0），121℃滅菌0.5h，10000r／min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)入10mL離心管，待測(cè)。此過(guò)程共5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4次。

高溫滅菌時(shí)間：取上一次試驗(yàn)結(jié)果最佳的土樣重量，加入相應(yīng)體積的20mmol／L檸檬酸緩沖液（pH 7.0），分別于121℃下滅菌0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0h。滅菌后，然后10000r／min離心5min，以空白為對(duì)照，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)染色法［8］于595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度。此過(guò)程共10個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4次。

離心時(shí)間：在高溫滅菌最佳時(shí)間的基礎(chǔ)上，進(jìn)行離心時(shí)間的處理，分別離心5、10、15、20、25min，取上清液測(cè)定其吸光值。共5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4次。

DE－GRSP的提取參考文獻(xiàn) ［4］離心時(shí)間的設(shè)計(jì)進(jìn)行：EE－GRSP離心后的沉淀使用8mL 50mmol／L檸檬酸緩沖液 （pH 8.0）高壓滅菌1h，然后分別10000r／min離心5、10、15、20、25min，取上清液，測(cè)定其光密度。此過(guò)程共5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SAS 8.1軟件的ANOVA過(guò)程對(duì)處理間作差異性的測(cè)驗(yàn)，采用Duncan法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣重量對(duì)EE－GRSP提取量的影響

圖1所示為不同土樣重量對(duì)EE－GRSP提取量的影響。結(jié)果顯示，在0.25～0.75g土壤重量范圍內(nèi)，EE－GRSP的提取量隨著土樣重量的增加而逐漸升高，且在0.75g時(shí)EE－GRSP的提取量最高，達(dá)到1.41mg／g。隨著土壤重量的繼續(xù)增加，EE－GRSP的提取量又逐漸下降，而后從1.0～1.25g時(shí)EE－GRSP的提取量又顯著地升高。因此，當(dāng)土樣重量為0.75mg／g時(shí)提取效果最好。因此，土樣重量為0.75g為后續(xù)試驗(yàn)的一個(gè)最佳條件。

2.2 高溫滅菌時(shí)間對(duì)EE－GRSP提取量的影響

圖2顯示，在土樣重量相同的情況下，不同的高溫滅菌時(shí)間顯著地影響了EE－GRSP的提取量，呈現(xiàn)出波浪狀起伏變化。高溫滅菌提取1h所測(cè)得的EE－GRSP值最高，當(dāng)高溫滅菌時(shí)間為1.5h時(shí)，EE－GRSP的提取量迅速降低，最低時(shí)下降了38.2%。而后隨著滅菌時(shí)間的增加，EE－GRSP的提取量表現(xiàn)出升高、降低以及再升高的趨勢(shì)。因此，在土樣重量為0.75g時(shí)，高溫滅菌提取1h時(shí)所得到的EE－GRSP含量最高。

圖1 土樣重量對(duì)柑橘根際EE－GRSP含量的影響

圖2 高溫滅菌時(shí)間對(duì)柑橘根際EE－GRSP含量的影響

2.3 離心時(shí)間對(duì) EE－GRSP和 DE－GRSP提取量的影響

圖3表明不同的離心時(shí)間對(duì)土樣中EEGRSP的提取量有顯著的影響。離心時(shí)間從5min到20min范圍內(nèi)，EE－GRSP的提取量隨著離心時(shí)間的增加而增加，在離心時(shí)間為20min時(shí)，EE－GRSP提取量達(dá)到最高。當(dāng)離心時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，EE－GRSP的提取量顯著降低。從圖3還可以看出，相比較于離心時(shí)間為20min而言，EE－GRSP的提取量降低了79.8%。

圖4顯示不同離心時(shí)間對(duì)DE－GRSP提取量的影響。當(dāng)離心時(shí)間為5min時(shí)，DE－GRSP提取量最低；離心10min時(shí)DE－GRSP的提取量最高，為0.58mg／g，但隨著離心時(shí)間的繼續(xù)增加，DE－GRSP的含量顯著降低，且在15～25min范圍內(nèi)DE－GRSP的提取量無(wú)顯著地變化。

圖3 離心時(shí)間對(duì)柑橘根際EE－GRSP含量的影響

圖4 離心時(shí)間對(duì)柑橘根際DE－GRSP含量的影響

3 討論與小結(jié)

前人對(duì)GRSP的提取都是按照 Wright等［1］描述的方法進(jìn)行，即土樣重量 （g）與緩沖液的體積（mL）的比例為1∶8。他們認(rèn)為，即使土樣重量不同，加入的緩沖液體積不同，只要提取比例一樣，所提取出的GRSP含量是沒(méi)有差異的。然而，本研究分別稱取了不同重量的土樣，然后按照相同的提取比例加入相應(yīng)的緩沖液，結(jié)果顯示在同一提取比例下，不同的土樣重量所提取的EE－GRSP含量有顯著地差異。當(dāng)土樣重量為0.75g時(shí)所提取出來(lái)的EE－GRSP含量達(dá)到最高，說(shuō)明在固定的1∶8提取比例下，當(dāng)檸檬酸緩沖液為6mL、土樣質(zhì)量為0.75g時(shí)，高溫提取能使土壤中的EE－GRSP釋放量達(dá)到最大。

本研究顯示，在EE－GRSP的提取過(guò)程中，不同的滅菌時(shí)間對(duì)EE－GRSP的提取有一定的影響，在高溫滅菌1h所提取出來(lái)的EE－GRSP含量最高，暗示土壤滅菌過(guò)程中高溫的時(shí)間延長(zhǎng)可能使土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合的GRSP釋放更徹底。但是隨著高溫時(shí)間的延長(zhǎng) （超過(guò)1h），反而導(dǎo)致EE－GRSP含量的下降，進(jìn)一步暗示了EE－GRSP可能不能忍受長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理，導(dǎo)致大量降解。

本研究結(jié)果也表明，土壤樣品為0.75g與檸檬酸緩沖液為6mL混合，高溫滅菌后，分別離心5、10、15、20min和25min，發(fā)現(xiàn)在5～20min內(nèi)，隨著離心時(shí)間的不斷升高，所提取的EE－GRSP含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在離心時(shí)間為20min時(shí)達(dá)到最大；對(duì)于DE－GRSP而言，則在離心時(shí)間為10min時(shí)達(dá)到最大。謝小林等［9］發(fā)現(xiàn)離心力大小顯著影響了土壤顆粒的分離，離心力越大可分離更多更細(xì)的土壤微粒，從而對(duì)GRSP定量測(cè)定的干擾就越少。因此，建議在提取GRSP時(shí)，應(yīng)加大離心力或者適當(dāng)增加離心時(shí)間，以便從土壤中分離到純度更高的GRSP成分。

簡(jiǎn)而言之，對(duì)土壤中EE－GRSP的提取中，建議宜稱取0.75g土樣，加入6mL 20mmol／L檸檬酸緩沖液 （pH 7.0），高溫滅菌1h，然后10000r／min離心20min，DE－GRSP采用10000r／min離心10min。采用上述過(guò)程，可以較準(zhǔn)確地測(cè)定土壤中GRSP含量，減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程造成的誤差。不同類型的土壤在進(jìn)行GRSP的提取過(guò)程中還需要進(jìn)一步地校正。

［1］ Wright S F，Upadhyaya A.Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi［J］.Soil Science，1996，161：575～586.

［2］ Rillig M C.Arbuscular mycorrhizae，glomalin，and soil aggregation ［J］.Canadian Journal of Soil Science，2004，84：355～363.

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［5］ Rillig M C，Wright S F，Allen M F，et al.Rise in carbon dioxide changes soil structure ［J］.Nature，1999，400：628.

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［8］ Koidea R T，Peoplesa M S.Behavior of Bradford－reactive substances is consistent with predictions for glomalin ［J］.Applied Soil E－cology，2013，63：8～14.

［9］ 謝小林，許朋陽(yáng)，朱紅惠，等.球囊霉素相關(guān)土壤蛋白的提取條件 ［J］.菌物學(xué)報(bào)，2011，30（1）：92～99.