C型凝集素受體Langerin的細(xì)胞表達(dá)模型構(gòu)建及功能研究

張曉寧 張宇 羅陽 李巍 姚煦

C型凝集素受體Langerin的細(xì)胞表達(dá)模型構(gòu)建及功能研究

張曉寧 張宇 羅陽 李巍 姚煦

目的 構(gòu)建朗格漢斯細(xì)胞特異性C型凝集素受體Langerin體外細(xì)胞表達(dá)模型。方法 PCR方法獲得Langerin分子的cDNA，克隆入真核綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)載體pEGFP-C1（EGFP位于Langerin的N末端），轉(zhuǎn)染人腎胚細(xì)胞癌HEK 293T細(xì)胞后，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)EGFP-Langerin融合蛋白的細(xì)胞表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Langerin受體的表達(dá)，并進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)染表達(dá)的Langerin受體對(duì)塵螨抗原（nDer p 2）的識(shí)別和內(nèi)吞情況。結(jié)果 構(gòu)建的熒光融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞后，經(jīng)PCR及Western印跡檢測(cè)證明Langerin轉(zhuǎn)染及表達(dá)成功。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染Langerin融合質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞的Langerin受體表達(dá)率較轉(zhuǎn)染前增多約43%，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示綠色熒光標(biāo)記的Langerin成功表達(dá)，并可與紅色熒光素標(biāo)記的塵螨抗原（nDer p 2）結(jié)合，將nDer p 2內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論構(gòu)建的EGFP-Langerin融合蛋白在HEK293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后具有細(xì)胞表面受體分子的特征性分布，具有結(jié)合、內(nèi)吞過敏原功能。

樹突細(xì)胞；受體，有絲分裂原；重組融合蛋白質(zhì)類；塵螨科；HEK293細(xì)胞；受體，模式識(shí)別；Langerin

Langerin（CD207）是一種特異性表達(dá)于朗格漢斯細(xì)胞表面的C型凝集素受體，其結(jié)構(gòu)是一種Ⅱ型跨膜蛋白，胞外區(qū)包括頸部和一個(gè)C末端的C型碳水化合物識(shí)別區(qū)域（C-terminal C-type carbohydraterecognition domain,CRD）［1-2］，其中 CRD 可特異性識(shí)別多種含糖基結(jié)構(gòu)的病原菌受體，如，艾滋病病毒、酵母聚糖和白念珠菌、螺旋桿菌、蠕蟲等［3-4］，并具有內(nèi)吞功能［5］，因此Langerin蛋白在防御人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染、真菌感染免疫等方面起到重要作用［6］。鑒于Langerin的朗格漢斯細(xì)胞特異性表達(dá)以及與多種糖基結(jié)合的特點(diǎn)，推測(cè)Langerin可能同樣是富含多糖的過敏原抗原的靶受體。為進(jìn)一步了解Langerin與過敏原抗原的結(jié)合能力及內(nèi)吞功能，我們構(gòu)建可表達(dá)Langerin熒光融合蛋白的真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染工程細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞獲得瞬時(shí)表達(dá)，以激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)確定熒光融合蛋白的表達(dá)和功能。

資料與方法

一、資料

大腸桿菌DH5α（南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)），帶有綠色熒光蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)pEGFPC1載體質(zhì)粒（南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司）。HEK 293T細(xì)胞株（美國模式菌種收集中心ATCC）。Ex Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Xho I和Pst I內(nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA回收試劑盒（日本TaKaRa公司）。轉(zhuǎn)染試劑陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司），人來源的Langerin（CD207）單克隆cDNA（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司），Alexa Fluor-594熒光染料（美國life公司），來源于人的Langerin（CD207）熒光抗體（APC）（德國美天旎生物技術(shù)有限公司），nDer p2抗原（室內(nèi)，美國Biotechnologies公司）。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

二、方法

1.PCR方法制備Langerin序列片段：PCR反應(yīng)體系參照TaKaRa公司Ex Taq酶說明書，設(shè)25 μl體系。Langerin：上游引物：5′-CTCGAGCTATGACTG TGGAGAAGGAGGCCC-3′；下游引物：5′-CTGCAG TTACGGTTCTGATGGGACATAGGGT-3′。PCR 反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性 30 s；98℃變性 10 s，63℃退火30 s，72℃延伸 2 min，循環(huán) 25次，72℃延伸 5 min，4℃保存。PCR反應(yīng)完成后，利用15 g/L瓊脂糖電泳并切膠回收Langerin基因片段。引物中含有Xho I和Pst I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，膠回收產(chǎn)物L(fēng)angerin片段，分別以相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切后連接于pEGFPC1真核表達(dá)載體。

2.重組Langerin分子克隆及鑒定：按照TaKaRa公司T4 DNA連接酶的說明，將pEGFP-C1載體質(zhì)粒和Langerin基因片段用Xho I和Pst I內(nèi)切酶酶切，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收Langerin基因片段和載體pEGFP-C1。用T4 DNA連接酶連接雙酶切得到的Langerin基因片段和線性化載體，22℃連接2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，分別以卡那霉素篩選，挑取單克隆抗性菌落擴(kuò)增，小量抽提質(zhì)粒并做酶切鑒定，在813 bp對(duì)應(yīng)區(qū)域有條帶為陽性克隆，質(zhì)粒送南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

3.真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞：按照陽離子脂質(zhì)體Lipofectamin2000說明書將含Langerin的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，以pEGFP-C1空載體為對(duì)照。用RPMI培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，不含青鏈霉素）將HEK293T細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，按照每孔5×105細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板37℃5%CO2培養(yǎng)24 h，貼壁細(xì)胞數(shù)量達(dá)80%～90%時(shí)，用3 ml不完全RPMI培養(yǎng)基（不含胎牛血清）洗滌細(xì)胞兩次，加入1 ml不含胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。根據(jù)Lipofectamin2000說明書操作，質(zhì)粒與脂質(zhì)體終濃度比為1 μg：2 μl，將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入已鋪好細(xì)胞的12孔板中混勻后，5%CO2、37℃培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)染48 h后觀察結(jié)果。

4.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)重組EGFP-Langerin融合蛋白的表達(dá)：將轉(zhuǎn)染48 h的HEK293T細(xì)胞收集，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，4%甲醛固定30 min；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色 10 min 后激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光融合蛋白的表達(dá)情況。

5.PCR和Western印跡驗(yàn)證Langerin表達(dá)：

（1）PCR驗(yàn)證Langerin基因表達(dá)：HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，每106個(gè)細(xì)胞用1ml TRIzol試劑提取總mRNA，反轉(zhuǎn)為cDNA后，用小片段Langerin產(chǎn)物驗(yàn)證Langerin表達(dá)。小片段Langerin：上游引物 5′-GGGGACTCATCTACTGG-3′，下游引物5′-GACATAGGGTCGCTTACA-3′；β 肌動(dòng)蛋白：上游引物 5′-TCTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游引物 5′-AGGCATACAGGGACAGCAC-3′。PCR 反應(yīng)條件：95℃變性 3 min；94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃60 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)完成后，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增條帶。

（2）Western印跡驗(yàn)證 Langerin蛋白表達(dá)：HEK293T轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，裂解細(xì)胞每106個(gè)細(xì)胞用70 μl RIPA裂解液加入1×蛋白酶抑制劑和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF，美國Sigma公司）抽提總蛋白。將樣品蛋白和蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物依次上樣后，在5%牛血清白蛋白（BSA）溶液中室溫孵育2 h，應(yīng)用終濃度為2 mg/L。小鼠抗人Langerin一抗室溫孵育2 h，加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG與一抗結(jié)合，室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑作用后ChemiDocXRS系統(tǒng)顯影拍照。

6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)HEK293T細(xì)胞Langerin受體表達(dá)：將轉(zhuǎn)染48h的HEK293T細(xì)胞按約5×105/管收集入1.5 ml微量離心管，以未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞為陰性對(duì)照，根據(jù)Langerin熒光標(biāo)記抗體說明書加入Langerin-APC熒光抗體，避光孵育后上機(jī)檢測(cè)。

7.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)融合蛋白對(duì)戶塵螨過敏原（nDer p 2）攝?。菏斋@轉(zhuǎn)染后48 h的HEK293T細(xì)胞，根據(jù)熒光染料Alexa Fluor-594（分子探針）標(biāo)記天然純化過敏原nDer p 2，標(biāo)記后蛋白終濃度為0.6g/L。分3組加入35mg/LAlexaFluor-594標(biāo)記的nDer p 2過敏原，同時(shí)分3組加入相同濃度熒光抗體Alexa Fluor-594染料作為對(duì)照，在加入過敏原/染料后即刻（0 min）以及37℃、5%CO2孵育15 min、45 min后分別用4%甲醛固定 30 min，PBS洗3次，加入DAPI核染色劑避光孵育10 min，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光融合蛋白。

結(jié) 果

一、EGFP-Langerin融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR方法得到帶有Xho I和Pst I酶切位點(diǎn)的813 bp的Langerin全長(zhǎng)編碼框，酶切后連接入PEGFP-C1真核表達(dá)載體，構(gòu)建出Langerin蛋白N末端的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-Langerin。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Langerin用Xho I和Pst I酶切，電泳后得到2條片段，兩片段的位置與理論值一致（一條為813 bp，一條為線性載體片段4 892 bp，圖1），克隆成功。將質(zhì)粒送南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Langerin序列一致。

二、Langerin熒光融合蛋白表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h后，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)到有綠色熒光，提示EGFPLanerin融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)。48 h表達(dá)綠色熒光蛋白量增多，表達(dá)率超過40%（圖 2）。PCR后電泳觀察示，pEGFP-C1-Langerin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在233 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖3），pEGFP-C1空載體對(duì)照組無條帶出現(xiàn)（結(jié)果未顯示）。Western印跡顯示，pEGFP-C1-Langerin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在相對(duì)分子質(zhì)量36 000處有條帶證明Langerin表達(dá)，pEGFP-C1空載體對(duì)照組無條帶出現(xiàn)（圖4）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面Langerin受體表達(dá)情況，可見未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞不表達(dá)Langerin受體，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后HEK293T細(xì)胞Langerin表達(dá)率達(dá)43%（圖5）。

三、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Langerin融合蛋白對(duì)nDer p 2的攝取能力

在過敏原加入HEK293T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，有熒光素標(biāo)記的過敏原結(jié)合于膜表面的EGFP-Langerin融合蛋白上；37℃5%CO2孵育15 min后，熒光素標(biāo)記的過敏原逐漸分布至細(xì)胞內(nèi)部。37℃5%CO2孵育45 min后，熒光素標(biāo)記的過敏原進(jìn)一步內(nèi)吞至細(xì)胞內(nèi)（圖6）；而僅加入Alexa Fluor-594染料的對(duì)照組未見細(xì)胞膜表面熒光素結(jié)合現(xiàn)象（圖7）。

討 論

圖1 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Langerin用Xho I和Pst I雙酶切產(chǎn)物 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物，兩段大小分別為4 892 bp和813 bp

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Langerin重組質(zhì)粒融合蛋白的表達(dá) 2A：超過40%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細(xì)胞核呈藍(lán)色（×400）；2B：帶綠色熒光的融合蛋白（EGFP-Langerin）表達(dá)綠色熒光（×600）；2C：DAPI染細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（×600）；2D：2B與2C圖像融合后，EGFP-Langerin融合蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜上（×600）

朗格漢斯細(xì)胞是專職抗原提呈細(xì)胞［7-8］。C型凝集素受體是包括朗格漢斯細(xì)胞在內(nèi)的樹突細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體，其中Langerin是朗格漢斯細(xì)胞表面特異性的C型凝集素受體，因其表達(dá)的特異性以及抗原提呈、抵抗HIV感染等功能的多樣性受到研究者們的關(guān)注。Langerin蛋白的CRD為鈣離子依賴性糖基識(shí)別區(qū)域，因結(jié)構(gòu)較寬且空間相對(duì)穩(wěn)定，可識(shí)別特定結(jié)構(gòu)的糖蛋白或者細(xì)胞表面的抗原［8］，通過頸部形成 α 螺旋的三聚體形式［9］，CRD 可識(shí)別甘露糖、n乙酰葡糖胺和巖藻糖等糖蛋白配體，如艾滋病病毒、酵母聚糖等，不僅如此，CRD還能夠識(shí)別β-1,3葡聚糖，與β葡聚糖結(jié)合［10］，并具有內(nèi)吞功能［11］。多種過敏原均富含糖基結(jié)構(gòu)，我們經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Langerin受體可與多種富含多糖結(jié)構(gòu)的過敏原抗原如戶塵螨等特異性結(jié)合（結(jié)果未顯示），為進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞中Langerin與過敏原抗原結(jié)合及內(nèi)吞情況，我們構(gòu)建了Langerin細(xì)胞表達(dá)模型。

圖3 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)HEK293T細(xì)胞Lanerin表達(dá) M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：Langerin小片段；2：β肌動(dòng)蛋白約180 bp

圖4 Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞Langerin表達(dá) 1：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞langerin蛋白無表達(dá)；2：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)Langerin蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量36 000）；M：標(biāo)準(zhǔn)參照物

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HEK293T細(xì)胞表面表達(dá)Langerin受體橫坐標(biāo)為細(xì)胞表面抗Langerin熒光抗體Langerin-APC的紅色熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞相對(duì)數(shù)量；紅色曲線為未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞情況，藍(lán)色曲線為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的HEK293T細(xì)胞情況

圖6 Alexa Fluor-594標(biāo)記的nDer p 2與EGFP-Langerin融合蛋白結(jié)合及內(nèi)吞（×600） 6A：0 min時(shí)；6B：孵箱孵育15 min時(shí)；6C：孵箱孵育45 min時(shí)。其中EGFP-Langerin融合蛋白呈綠色熒光（左上角），DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（左下角），Alexa Fluor-594標(biāo)記的nDer p 2呈紅色熒光（右上角），三者融合情況（右下角）。隨時(shí)間推移可見融合蛋白和nDer p 2結(jié)合及nDer p 2內(nèi)吞 圖7 Alexa Fluor-594染料與HEK293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞膜表面EGFP-Langerin融合蛋白結(jié)合（×400） 7A：EGFP-Langerin融合蛋白呈綠色熒光；7B：Alexa Fluor-594染料呈紅色熒光；7C：DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；7D：7A～7C融合后，隨時(shí)間推移無明顯變化，均未見明顯結(jié)合與內(nèi)吞情況

HEK293T細(xì)胞系是常見的工程細(xì)胞，經(jīng)查證微弱或不表達(dá)Toll樣受體，少量表達(dá)部分C型凝集素受體，故本實(shí)驗(yàn)選擇HEK293T細(xì)胞為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Langerin的CRD與其他具有內(nèi)吞作用的C型凝集素受體如，DC-SIGN的跨膜結(jié)構(gòu)相似［9］。有研究認(rèn)為，將熒光蛋白EGFP置于DC-SIGN的C末端可能會(huì)影響DC-SIGN對(duì)配體的識(shí)別［10-11］，故本實(shí)驗(yàn)將EGFP置于Langerin的N末端，構(gòu)建熒光融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)PCR及Western印跡驗(yàn)證Langerin表達(dá)成功。經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白增多，Langerin表達(dá)率增加40%以上，因此可作為L(zhǎng)angerin細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)功能研究。激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Langerin主要為膜表達(dá)，試驗(yàn)中部分綠色熒光蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)，考慮可能是質(zhì)粒構(gòu)建過程中設(shè)計(jì)EGFP位于LangerinN末端，N末端表達(dá)的EGFP則表達(dá)于膜內(nèi)。

HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP-Langerin重組質(zhì)粒48 h后，根據(jù)熒光標(biāo)記的過敏原抗原經(jīng)過不同孵育時(shí)間與Langerin受體結(jié)合的情況，進(jìn)一步證實(shí)Langerin的細(xì)胞膜表面分布特征以及具有識(shí)別、結(jié)合、內(nèi)吞富含糖基結(jié)構(gòu)的功能。

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2014-09-30）

（本文編輯：尚淑賢）

Establishment and functional analysis of a cell model expressing the C-type lectin receptor Langerin

Zhang Xiaoning*,Zhang Yu,Luo Yang,Li Wei,Yao Xu.*Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Yao Xu,Email：drYao_xu@126.com

ObjectiveTo establish a cell model expressing the Langerhans cell-specific C type lectin receptor Langerinin vitro.MethodsThe cDNA of Langerin was obtained by PCR and cloned into a eukaryotic green fluorescent protein（EGFP）expression vector pEGFP-C1 with EGFP located in the N terminal region of the Langerin gene.Then,the recombinant plasmid was transfected into a human embryonic kidney carcinoma cell line HEK293T.Subsequently,laser confocal microscopy was performed to observe the expression of EGFP-Langerin fusion protein,and flow cytometry to measure the expression of Langerin.Laser confocal microscopy was also conducted to visualize the recognition and endocytosis of dust mite antigen （nDer p 2）by Langerin.ResultsPCR and Western blot confirmed the successful transfection of HEK293T cells with the recombinant plasmid as well as the expression of Langerin in the transfected cells.As flow cytometry revealed,the expression level of Langerin in transfected HEK293T cells was increased by 43%compared with untransfected cells.Laser confocal microscopy showed that green fluorescein-labeled Langerin was successfully expressed,and could bind to and endocytose the red fluorescein-labeled antigen nDer p 2.ConclusionsThe fusion protein EGFP-Langerin expressed in HEK293T cells showed the distribution characteristic of cell surface receptors,and could bind to and endocytose allergens.

Dendritic cells;Receptors,mitogen;Recombinant fusion proteins;Pyroglyphidae;HEK293 cells;Receptors,pattern recognition;Langerin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.012

國家自然科學(xué)基金（81371735），2014年度亞美醫(yī)學(xué)基金會(huì)（MMAAP）皮膚病項(xiàng)目基金

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所（張曉寧、張宇、羅陽、姚煦）；第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院（李巍）

姚煦，Email：drYao_xu@126.com