獸藥三黃散超微粉中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的高效液相色譜法測定

張盈嬌++夏陳++陳建

摘要 [目的]建立獸藥三黃散超微粉中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的高效液相色譜法測定方法。[方法]采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱ZORBAX Eclipse XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，黃芩苷和鹽酸小檗堿的檢測波長分別為278 nm和347 nm，流動(dòng)相：乙腈-2 mL/L磷酸水溶液（體積比25∶75），柱溫30 ℃；流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10 μL。[結(jié)果]黃芩苷、鹽酸小檗堿進(jìn)樣量分別在0.1180～1.1800、0.051 6～0.516 0 μg（R2=0.999，n=6）范圍內(nèi)與其各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為101.696%、100.604%（n=6）。[結(jié)論]此方法精確、快速，重現(xiàn)性和精密度良好，可為獸藥三黃散超微粉的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 三黃散超微粉；黃芩苷；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法

中圖分類號(hào) S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2015）18-0266-02

Simultaneous Determination of Baicalin and Berberine Hydrochloride in Sanhuang San for Animals by HPLC

ZHANG Ying-jiao XIA Chen CHEN Jian *

（Institute of Agro-food Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu Sichuan 610066）

Abstract [Objective] To establish a HPLC method for simultaneous determination of baicalin and berberine hydrochloride in Sanhuang San of veterinary drugs.[Method] The content determination was performed on ZORBAX Eclipse XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），with the mobile phase consisted of acetonitrile-2 mL/L phosphoric acid（25∶75）.The flow rate was 1.0 mL/min，and the detection wavelength of baicalin and berberine hydrochloride was set at 278 nm and 347 nm.The column temperature was maintained at 30 ℃ and injection volume was 10 μL.[Results] The linear range of baicalin and berberine hydrochloride were from 0.1180 to 1.1800 μg（R2=0.999，n=6）and from 0.051 6 to 0.516 0 μg（R2=0.999，n=6），respectively，and the average recoveries were 101.696% and 100.604%（n=6），respectively.[Conclusion] The method was simple，accurate，re-producible and precise，which would be suitable for contents determination，quality control and evaluation of baicalin and berberine hydrochloride in Sanhuang San of veterinary drugs.

Key words Sanhuang San；baicalin；berberine hydrochloride；HPLC

獸藥三黃散超微粉主要由黃柏、黃芩、大黃等組成，主治細(xì)菌性敗血癥、爛鰓、腸炎和赤皮，適用于各類水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物[1]。黃芩苷（baicalin）和鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride）是主要有效成分，黃芩苷是一種黃酮類化合物，具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)及解痙作用，在清除氧自由基、減輕組織的缺血、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多方面均有作用[2-3]。鹽酸小檗堿是一種異喹啉生物堿，又稱黃連素（umbellatine），對痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌等有抑制作用，主要用于胃腸道感染及菌痢等[4-5]。顯然，黃芩苷、鹽酸小檗堿含量高低直接影響三黃散超微粉的藥效。

超微粉碎技術(shù)可將中藥材粉碎到粒徑1～75 μm，是近年來中藥加工的一項(xiàng)新技術(shù)，該技術(shù)改善了中藥的品質(zhì)，提高了中藥的生物利用度，推動(dòng)了中藥的標(biāo)準(zhǔn)化，是中藥現(xiàn)代化的重要途徑之一。

本試驗(yàn)采用雙波長高效液相色譜法測定三黃散超微粉中黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果表明：該方法重現(xiàn)性和精密度均良好，適用于三黃散超微粉中黃芩苷、小檗堿的含量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

色譜儀：安捷倫1260高效液相色譜儀；色譜柱：ZORBAX Eclipse XB-C18鍵合硅膠柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），美國安捷倫公司生產(chǎn)；KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司：FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

黃芩苷：成都普思生物科技有限公司，批號(hào)DS10121401；鹽酸小檗堿：中國食品藥品檢定研究所，批號(hào)110713-201212；無水甲醇：分析純，濟(jì)寧佰一化工有限公司；乙腈：色譜純，sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；磷酸：分析純，成都市科龍化工試劑廠；三黃散超微粉：四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司，250 g/袋，批號(hào)：20150325、20150618、20150517。endprint

1.2 色譜條件[6-7]

色譜柱為ZORBAX Eclipse XB-C18鍵合硅膠柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；黃芩苷和鹽酸小檗堿的檢測波長分別為278 、347 nm，流動(dòng)相為乙腈—2 mL/L磷酸水溶液（25∶75）；流速為1.0 mL/min。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸小檗堿23.6、17.2 mg，分別置于50 mL棕色容量瓶中，分別加甲醇溶解，定容，得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別量取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液25、15 mL，置于100 mL棕色容量瓶中混合，加甲醇定容，用孔徑為0.45 μm的微孔過濾膜濾過，即得濃度分別為0.118 0、0.051 6 mg/mL的黃芩苷、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。

1.3.2 供試品溶液 。取三黃散超微制劑（批號(hào)：20150325）約100 g，混合均勻，精密稱取0.5 g，置于25 mL錐形瓶中，加入甲醇25 mL，靜置1 h后超聲波處理1 h，靜置至室溫后用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，過濾，將濾液用0.45 μm的微孔過濾膜過濾，即得。

1.3.3 陰性對照溶液。按三黃散超微粉的處方和制備工藝[1]，按1.3.2的方法制備不含黃芩、黃柏的陰性對照溶液。

1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按1.2色譜條件檢測，計(jì)算色譜柱的理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子[8-9]。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系考察 。精密量取1.3.1中的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶，加甲醇定容，搖勻，即得梯度標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液各10 μL，按1.2中色譜條件測定，以峰面積積分值y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別量取1.3.2中的供試品溶液，在室溫下，于第0、2、4、6、8、12小時(shí)進(jìn)樣量10 μL，按1.2中色譜條件測定，計(jì)算黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均峰面積積分值和RSD。

1.5.3 精密度試驗(yàn)。精密量取1.3.1中標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液10 μL，按1.2中色譜條件重復(fù)測定6次，計(jì)算二者的平均峰面積積分值和RSD。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取同批號(hào)為20150325的樣品共6份，按1.3.2方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL，按1.2中色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算二者的含量和RSD。

1.5.5 加樣回收試驗(yàn)[10]。稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20150325，黃芩苷和鹽酸小檗堿的平均含量分別為11.63、19.85 mg/g）6份，每份約0.05 g，置錐形瓶中，分別精密加入1.3.1中標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL，另精密移取甲醇溶液20 mL，加入上述錐形瓶中，按1.3.2中方法制備供試品溶液，按1.2中色譜條件測定樣品含量，計(jì)算加樣回收率。

1.6 樣品含量的測定

分別取3批樣品，按1.3.2方法制備供試品溶液，按照1.2中色譜條件測定含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

由圖1～4可知，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液中黃芩苷、鹽酸小檗堿的特征峰保留時(shí)間相同，二者的色譜峰與其相鄰未知色譜峰的分離度良好。陰性對照色譜圖（圖5～6）中未出現(xiàn)雜質(zhì)峰，表明本法專屬性強(qiáng)，陰性對照溶液對測定無干擾。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系。檢測結(jié)果表明，黃芩苷、鹽酸小檗堿的回歸方程分別為y=2 9 952x-10.54（R2=0.999，n=6）、y=21 863x+8.279（R2=0.999，n=6），黃芩苷、鹽酸小檗堿進(jìn)樣量分別在0.118 0～1.180 0、0.051 6～0.516 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均峰面積積分（下轉(zhuǎn)第269頁）

值分別為1 366.7、1 886.2，RSD分別為0.51%、0.19%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定（n=6）。

2.2.3 精密度試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)品溶液中黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均峰面積積分值分別為3 106.7、1 287.3，RSD分別為0.39%、0.29%，表明儀器精密度良好（n=6）。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)。樣品中黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均含量分別為11.63、19.85 mg/g，RSD分別為0.83%、1.14%，表明方法重復(fù)性良好（n=6）。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 。由表1、2可知，黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為101.696%、100.604%，RSD分別為1.655%、1.213%。這表明本方法回收率高，分離效果好。

2.3 樣品含量的測定

經(jīng)測定，批號(hào)20150325、20150517、20150618樣品中黃芩苷含量分別為11.630 0、11.744 7、11.669 1 mg/g，鹽酸小檗堿含量分別為19.850 0、20.212 5、19.880 8 mg/g。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，流動(dòng)相的選擇是關(guān)鍵。本試驗(yàn)參考《中華人民共和國藥典》2010版（一部）[11]，比較了不同流動(dòng)相的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈和2 mL/L磷酸水溶液為流動(dòng)相分離效果最好。并且乙腈—2 mL/L磷酸水溶液體積比為25∶75時(shí)，黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰形良好，與其他干擾峰分離度均大于1.5。

試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可準(zhǔn)確地進(jìn)行定性、定量檢測，能排除其他成分干擾，重復(fù)性好，可用于三黃散超微粉的質(zhì)量控制。

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