白藜蘆醇對喉癌Hep－2細胞順鉑敏感性的增強作用及其機制

戰(zhàn)仕花，王 蘋，尹萬忠，祝 威

（吉林大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長春 130021）

目前順鉑（cisplatin，DDP）已經應用于多種腫瘤的一線聯(lián)合化療方案中，但其具有腎毒性、消化道毒性、骨髓抑制和耳毒性等不良反應［1］，因此其用量及聯(lián)合配伍受到限制。白藜蘆醇（resveratrol，Res）具有抗腫瘤、抗炎、肝臟保護、神經保護、心血管保護和免疫調節(jié)等多種生物學活性，其中最具研究前景的是其抗腫瘤效應［2］。目前研究［3－6］顯示：白藜蘆醇具有激活sirtuin，降低DDP引起的腎毒性、耳毒性和心臟損傷等的作用。沉默信息調節(jié)因子2（silent information regulator 2，Sir2）相關酶1（Sirt1）是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotin－amide adenine dinucleotide，NAD）的去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC），Sirt1與多種細胞生物學功能有關聯(lián)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用［7］。sirtuins是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的Sir2的同源物，其中Sirt1是研究較深入的一個成員。Sirt1以許多非組蛋白和組蛋白為底物，與多種細胞生物學功能如基因轉錄沉默、細胞生長周期調節(jié)等有密切關聯(lián)，Sirt1作為治療不同疾病的靶點逐漸被人們重視，Sirt1不僅參與了其壽命的調節(jié)，而且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的作用［8］。但在許多腫瘤細胞中其作用仍存在爭議。Sirt1在多種惡性腫瘤中存在過表達的情況，作為腫瘤促進因子［9］。Sirt1在部分惡性腫瘤如膠質母胞瘤中表達水平有所降低［10］。Wang等［11］發(fā)現(xiàn)：Sirt1的表達水平在許多其他類型腫瘤中降低，包括膠質母細胞瘤、膀胱癌前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肝癌等，Sirt1在這些組織中起腫瘤抑制因子作用而非腫瘤促進因子的作用。有研究［12］顯示：白藜蘆醇增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，目前尚未有研究將白藜蘆醇和DDP聯(lián)合應用于喉癌細胞。本實驗擬采用白藜蘆醇聯(lián)合DDP作用于喉癌細胞，觀察白藜蘆醇對DDP化療的增敏作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人喉鱗狀細胞癌Hep－2細胞株由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供。RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國Gibco公司），Triton X－100、白藜蘆醇、DDP（美國Sigma公司），sirtinol（美國Cayman公司），Sirt1多克隆抗體（北京博奧森公司），CCK－8、Annexin VFITC Kit（碧云天生物研究所）。超凈工作臺JDJ－203（蘇州凈化設備廠），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），BX50熒光顯微鏡、FV1000型激光共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組人喉鱗狀細胞癌 Hep－2細胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100U·mL－1的青霉素和100U·L－1的鏈霉素1640培養(yǎng)基中，在飽和溫度、37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。當細胞生長處于對數(shù)生長期時，將細胞接種于96孔板、9.6cm2小皿和圓形載玻片。細胞分為空白對照組和DDP組（3、6、12和24μmol·L－1），選出DDP的最佳濃度用于以下分組。對照組、DDP組、白藜蘆醇組、sirtinol組、白藜蘆醇＋sirtinol組、白藜蘆醇＋DDP組、sirtinol＋DDP組、白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組。白藜蘆醇＋sirtinol組細胞加藥時先加白藜蘆醇，1h后加DDP；白藜蘆醇＋DDP組和sirtinol＋DDP組細胞加藥時先加白藜蘆醇或sirtinol，1h后加DDP；白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組加藥時先加白藜蘆醇，1h后加sirtinol，再過1h后加DDP。最終藥物的作用濃度為：白藜蘆醇50μmol·L－1，sirtinol 40 μmol· L－1，DDP 6μmol·L－1。

1.3 CCK－8法檢測細胞生存率 選對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后，鋪于96孔板內，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h至細胞密度為80%后加藥；CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；在超凈臺中將96孔板中培養(yǎng)基換為不含血清及抗生素的1640培養(yǎng)基100μL，然后加入CCK－8試劑10μL；37℃孵育2h；在酶標儀450nm處檢測吸光度（A）值，計算細胞生存率。細胞生存率＝（實驗組A值－空白組A值）／（對照組A值－空白組A值）×100%。

1.4 免疫熒光法檢測細胞中Sirt1蛋白表達 選對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后，鋪于圓形載玻片并標記，待細胞密度達40%時加藥。室溫下4%多聚甲醛溶液固定30min，PBS漂洗3次，每次5min；加入1%Triton X－1001.5mL打孔10min后，PBS漂洗3次，每次5min；滴加5%山羊血清，于室溫下放置1h；加入Sirt1抗體（1∶100），4℃孵育過夜；0.1mol·L－1PBS在搖床上漂洗3次，加入Alexa 488綠色山羊抗兔抗體（1∶200稀釋），室溫避光靜置1h；0.1mol·L－1PBS漂洗3次，每次5min；90%甘油封片，熒光顯微鏡進行觀察，拍照。圖像中的綠色熒光顯示Sirt1蛋白表達陽性，隨機取3個視野用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測平均熒光強度。熒光強度越強提示Sirt1蛋白表達越多。

1.5 Annexin V－FITC Kit法檢測細胞凋亡率 選對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后，鋪于小皿中并標記，待細胞密度達80%時加藥。加藥培養(yǎng)步驟同CCK－8中的加藥步驟。移去培養(yǎng)基后用 Hank’s液洗滌；查細胞數(shù)，胰酶消化；加1×binding Buffer 1mL，300g離心10min，移去上清，加入1×binding Buffer 100μL重懸細胞；加10μL Annextin V－FITC，混勻后室溫下孵育15min；加1×binding Buffer 1mL，300g離心10min，移去上清。加入1×binding Buffer 500μL重懸細胞；加入5μL PI solution立即進行鋪片，應用熒光顯微鏡進行觀察，拍照。綠色熒光顯示早期的細胞凋亡，紅色熒光顯示晚期的凋亡和壞死細胞。細胞凋亡率＝同一視野下凋亡細胞數(shù)／細胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad Prism統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。細胞生存率、平均免疫熒光強度和細胞凋亡率以表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組Hep－2細胞的生存率 CCK－8法檢測6、12、24和48h各組Hep－2細胞生存率，與空白對照組比 較，12、24和48h 時，6、12、24μmol·L－1DDP組細胞生存率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），見表1。CCK－8檢測細胞生存率，與對照組比較，DDP組（78.42%）、白藜蘆醇組（87.35%）、白藜蘆醇＋DDP組（69.53%）、sirtinol＋DDP組（86.77%）和白藜蘆醇＋sitinol＋DDP組（81.69%）細胞生存率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。與DDP組比較，白藜蘆醇＋DDP組細胞生存率明顯下降（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋DDP組比較，白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組細胞生存率明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表1 不同時間點和DDP濃度各組Hep－2細胞生存率Tab.1 Survival rates of Hep－2cells in various groups treated with different concentrations of DDP at different time points（n＝3，，η／%）

表1 不同時間點和DDP濃度各組Hep－2細胞生存率Tab.1 Survival rates of Hep－2cells in various groups treated with different concentrations of DDP at different time points（n＝3，，η／%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with blank control group.

6 12 24 48 Blank control 100.00±0.00 100.00±0.00 100.0 Group Survival rate（t／h）0±0.00 100.00±0.00 DDP（μmol·L－1）3 98.81±2.06 98.38±2.70 98.58±7.40 92.48±5.76 100.24±1.81 92.08±0.39＊ 89.08±4.30＊＊ 80.28±2.2＊＊12 97.63±2.34 85.61±1.20＊＊ 82.42±7.07＊＊ 82.97±1.45＊＊24 97.75±2.28 80.77±5.15＊＊ 59.87±4.95＊＊ 47.60±5.15＊＊

2.2 各組Hep－2細胞中Sirt1蛋白表達強度 與對照組比較，白藜蘆醇組、DDP組和白藜蘆醇＋DDP組細胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強度均明顯升高（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋sirtinol組比較，白藜蘆醇組細胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強度明顯升高（P＜0.01）。與sirtinol＋DDP組比較，DDP組細胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強度明顯升高（P＜0.01）。與 DDP組比較，白藜蘆醇＋DDP組細胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強度明顯升高（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋sirtinol＋DDP組比較，白藜蘆醇＋DDP組細胞中Sirt1蛋白平均免疫熒光強度明顯升高（P＜0.01）。見圖1（插頁三）和表3。

表2 各組Hep－2細胞生存率Tab.2 Survival rates of Hep－2cells in various groups（n＝3，，η／%）

表2 各組Hep－2細胞生存率Tab.2 Survival rates of Hep－2cells in various groups（n＝3，，η／%）

＊P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs DDP group；#P＜0.05 vs sirtinol＋DDP group.

Group Survival rate Control 100.00±0.00 DDP 78.42±1.35＊Resveratrol 87.35±1.25＊Resveratrol＋DDP 69.53±0.45＊△Sirtinol＋DDP 86.77±1.76＊Resveratrol＋sirtinol＋DDP 81.69±6.33＊#

表3 各組Hep－2細胞中Sirt1蛋白的平均免疫熒光強度Tab.3 Mean fluorescence intensities of Sirt1protein in Hep－2cells in various groups （n＝3，）

表3 各組Hep－2細胞中Sirt1蛋白的平均免疫熒光強度Tab.3 Mean fluorescence intensities of Sirt1protein in Hep－2cells in various groups （n＝3，）

＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.01compared with DDP group；#P＜0.01compared with resveratrol group；▲P＜0.01compared with resveratrol＋DDP group.

Group Mean fluorescence intensit y Control 103.73±10.65 DDP 134.30±12.65＊Resveratrol 200.67±21.35＊Resveratrol＋DDP 169.90±14.93＊△#Sirtinol 87.07±4.93 Sirtinol＋DDP 111.43±5.61△Resveratrol＋sirtinol 108.07±5.34#Resveratrol＋sirtinol＋DDP 127.70±13.37##▲

2.3 各組細胞凋亡率 與對照組（4.39%±0.65%）比較，白藜蘆醇＋DDP組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。與DDP組（12.89% ±0.56%）比較，白藜蘆醇＋DDP組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇＋DDP組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。與白藜蘆醇＋DDP＋sirtinol組（12.37%±0.99%）比較，白藜蘆醇＋DDP組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。見圖2（插頁三）。

3 討 論

臨床上喉癌的化療以應用DDP為主，本研究中CCK－8實驗的檢測結果也提示DDP可抑制Hep－2細胞的生長，促進 Hep－2細胞的凋亡。DDP在抗腫瘤作用的同時，同樣表現(xiàn)出腎毒性、耳毒性、神經毒性和骨髓抑制的不良反應［1］。Lee等［13］研究發(fā)現(xiàn)：DDP與耳蝸組織結合后可激發(fā)產生大量的自由基，諸如超氧化物、過氧化氫等，進而引起內耳損傷。王黎等［14］研究發(fā)現(xiàn)：DDP引起腎毒性的發(fā)病機制主要與氧化應激機制有關聯(lián)。DDP的毒性限制其在臨床化療中的應用，針對降低DDP毒性作用的聯(lián)合化療方案仍有待開發(fā)。

白藜蘆醇是一種廣泛存在于葡萄、虎杖和花生等多種植物中的多酚化合物，是植物為抵抗外界刺激如紫外線、真菌、病毒感染或機械損傷而產生的一種植物抗毒素。白藜蘆醇具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等抗腫瘤作用，也有抗心血管疾病、抗炎、免疫調節(jié)和抗衰老等生物學作用。在肝癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌和白血病等多種腫瘤細胞中白藜蘆醇均有顯著抑制腫瘤的作用［15］。白藜蘆醇有抗腫瘤作用，可減少DDP引起的大鼠心臟毒性、內耳損傷和腎毒性［4－6］。Bj?rklund等［16－18］研究發(fā)現(xiàn)：白藜蘆醇也能提高卵巢上皮癌細胞對順鉑的敏感度。本研究結果顯示：白藜蘆醇可抑制喉癌Hep－2細胞生長，促進喉癌Hep－2細胞凋亡。

Sirt1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?，白藜蘆醇具有激活Sirt1的作用［3］。Sirt1以組蛋白和非組蛋白為底物進行去乙?；瑓⑴c多種細胞生物學功能如基因轉錄沉默、細胞生長周期調節(jié)等。本研究中細胞免疫熒光檢測結果顯示：喉癌Hep－2細胞中表達Sirt1蛋白，白藜蘆醇作用后Hep－2細胞中Sirt1蛋白過表達，DDP也能提高喉癌Hep－2細胞中Sirt1蛋白的表達，白藜蘆醇和DDP聯(lián)合應用后Hep－2細胞中Sirt1蛋白過表達。DDP和白藜蘆醇抑制Hep－2細胞增殖和促進凋亡作用可能部分是由Sirt1蛋白表達增加引起。

綜上所述，DDP在抗腫瘤作用的同時，表現(xiàn)出的腎毒性、耳毒性、神經毒性、心臟毒性和骨髓抑制等不良反應限制其臨床應用。本研究結果顯示：與單獨使用DDP比較，白藜蘆醇與DDP聯(lián)合作用時Hep－2細胞生長明顯被抑制，細胞凋亡明顯增加，提示白藜蘆醇增加了Hep－2細胞對DDP的敏感性，其機制可能與白藜蘆醇提高Hep－2細胞中Sirt1蛋白表達，導致Hep－2細胞對DDP的敏感性增加有關。本研究可能為喉癌的化療提供新思路、新線索和新方法。

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