金黃色葡萄球菌IsdB表位蛋白與HBc蛋白融合表達

白 靚，成 巖，徐芳菲，劉 燕，張樹軍，曹瑞珍

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，吉林 集安 134200）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一種廣泛存在人和動物體內(nèi)的革蘭陽性球菌，可以在皮膚、泌尿生殖道、消化道和呼吸道引起化膿性感染，嚴重者可以引起全身性膿毒血癥［1］。金黃色葡萄球菌在漫長的進化過程中，出現(xiàn)了大量的耐藥株，以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的威脅程度最大，其降低了抗生素療法的可靠性，美國每年感染MRSA的新增患者達180萬例［2］。鐵調(diào)節(jié)表面決定因子B（ironregulated surface determinant B，IsdB）是存在于金黃色葡萄球菌體表面的一種蛋白抗原，相對分子質(zhì)量約為72000，功能是從血紅蛋白中捕獲鐵分子并向細菌內(nèi)轉(zhuǎn)運［3］。IsdB具有強免疫原性，在金黃色葡萄球菌中高度保守［4］。而IsdB最小構(gòu)象表位位于50－285aa中，該片段誘導(dǎo)的抗體具有免疫調(diào)節(jié)作用［5］，為進一步提高IsdB的免疫原性，本課題組嘗試使用HBc作為疫苗載體。乙型肝炎病毒核心（hepatitis B virus core，HBc）蛋白作為載體具有佐劑特性，HBc截短成144aa后能攜帶外源蛋白表位誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強適應(yīng)性免疫應(yīng)答，尤其可以產(chǎn)生針對外源表位的特異性抗體［6］。使用HBc作為載體的疫苗研究領(lǐng)域涉及結(jié)核桿菌、流感病毒、惡性瘧原蟲、艾滋病毒和黑色素瘤等［7］。張占東等［8］利用原核表達 HBc－VEGF融合蛋白，并通過免疫小鼠分析重組融合蛋白的免疫原性，發(fā)現(xiàn)小鼠能夠產(chǎn)生針對VEGF抗原表位的特異性抗體，為腫瘤治療研究提供了新方法。Yin等［9］使用HBc與炭疽芽孢桿菌PA抗原表位（302－325）融合表達，發(fā)現(xiàn)該抗原能夠在小鼠及豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生保護性抗體，可作為疫苗預(yù)防炭疽感染。進一步分析融合抗原的免疫機制發(fā)現(xiàn)：刪除HBc蛋白中的79－81aa的免疫顯性區(qū)可以提高HBC蛋白的正確折疊及提高免疫效果［10］。而將HBc與金黃色葡萄球菌IsdB表位進行融合表達，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本研究以HBc為抗原載體，與IsdB50－285蛋白融合表達，并評價該融合蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體能力及免疫保護效果，為預(yù)防性金黃色葡萄球菌疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、基因、質(zhì)粒、菌株、主要試劑和儀器 40只BALB／c小鼠，雌性，4周齡，購自吉林大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉 ） 2008－0005；HBc（GenBank，JX848113.1），IsdB（GenBank，5330644 ）；pET28a（＋）載體及其表達菌BL21（美國Novagen公司）；大腸桿菌（DH5α）、金黃色葡萄球菌Newman株由內(nèi)蒙古民族大學(xué)生生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)實驗中心保存；限制性核酸內(nèi)切酶（美國Thermo公司），DNA相對分子質(zhì)量標準、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準 ［天根生物科技（北京）有限公司］，HRP標記的羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋公司），rIsdB蛋白由內(nèi)蒙古民族大學(xué)生物化學(xué)實驗室制備保存，弗氏佐劑（美國Sigma公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；Amicon Ultra－15超濾離心管（截留相對分子質(zhì)量為3000，美國Millipore公司）。

1.2 基因設(shè)計與合成 依據(jù)GenBank公布的序列，設(shè)計目的基因HBc－IsdB50－285，IsdB50－285（236aa）插入替換 HBc（N端1～144aa）的第76～82位aa，見圖1。基因上游引入NcoⅠ序列，下游引入XhoⅠ序列?；蛴缮虾Ｉす竞铣?，質(zhì)粒命名pUC57－HBc－IsdB50－285。

圖1 HBc蛋白構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of construction of HBc protein

1.3 pET28－HBc－IsdB50－285載體構(gòu)建與表達 使用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切pUC57－HBc－IsdB50－285和pET28a（＋）質(zhì)粒。回收試劑盒分別回收目的基因與載體，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)酶切、測序鑒定陽性載體。將鑒定含有 pET28－HBc－IsdB50－285的BL21（DE3）菌株接種于10mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h，培養(yǎng)產(chǎn)物以1∶50接種于50mL LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至600nm處吸光度A600＝0.5～0.8時，取出5mL作為未誘導(dǎo)對照，剩余培養(yǎng)液加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，終濃度為 0.5mmol L－1，培養(yǎng)6h。取2管菌液每管1mL檢測蛋白表達情況及目標蛋白的可溶性，12000r·min－1離心10min，一管保留菌體備用；另一管棄上清更換緩沖液（250mmol·L－1NaCl，20mmol·L－1Tris－HCl，pH7.9，0.1mmol·L－1DTT）重懸，冰浴條件下超聲破碎菌體后，12000r·min－1離心10min，分別對全菌體與超聲破碎上清進行12%SDSPAGE分析。

1.4 HBc－IsdB50－285的純化 根據(jù)目的蛋白 C 末端攜帶組氨酸標簽，選擇鎳柱親和層析純化目的蛋白，取超聲破碎菌液30mL調(diào)pH 值至7.9，0.45μm濾器過濾后上樣至經(jīng)0.2mol·L－1NiSO4洗滌的Chelating Sepharose FF 10mL柱，結(jié)合緩沖液（250mmol·L－1NaCl，20mmol·L－1Tris－HCl，10mmol·L－1咪唑，pH7.9），平衡上樣后梯度洗脫收集洗脫峰，洗脫緩沖液（250mmol·L－1NaCl，20mmol·L－1Tris－HCl，300mmol·L－1咪唑，pH7.9），12%SDS－PAGE鑒定純化的目的蛋白。BandScan 5.0分析軟件分析電泳結(jié)果，計算蛋白純度，對純化蛋白使用超濾離心管除去咪唑及更換緩沖液為PBS，參照BCA蛋白定量試劑盒，取0.1mL純化蛋白進行蛋白定量。

1.5 動物分組及給藥 40只BALB／c小鼠隨機分為 HBc－IsdB50－285組、HBc－IsdB50－285添加佐劑組、rIsdB添加佐劑組和PBS組，每組10只。第0天和第11天小鼠腿部肌肉注射2次，劑量為每只100μg。首次與弗氏完全佐劑等體積混合，末次與弗式不完全佐劑等體積混合。小鼠免疫后在第11和20天尾靜脈采血（每次0.1mL）。

1.6 小鼠血清抗 HBc－IsdB50－285抗體檢測 使用間接ELISA法，分別取rIsdB、HBc－IsdB50－285100μL包被酶標板，每孔0.4μg，次日置于200μL含有BSA的封閉液中反應(yīng)1h。分別檢測4組免疫小鼠的血清，小鼠血清按1∶100倍稀釋的初始濃度加入酶標板內(nèi)100μL，按1∶100倍比稀釋法稀釋（陰性對照，每孔為PBS免疫的動物血清），37℃孵育1h，洗滌液沖洗5遍后加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶1000），每孔100μL，室溫反應(yīng)2h，洗滌及TMB顯色，用酶標儀測每孔A450值，樣品A450值≥2.1×陰性對照A450值即判定為陽性。

1.7 小鼠攻毒實驗 ?。?0℃凍存的金黃色葡萄球菌液30μL接種至10mL TSB復(fù)壯培養(yǎng)。取1mL培養(yǎng)菌接種入50mL TBS培養(yǎng)液中放大培養(yǎng)，當 A600＝1.0 時，取細菌5000r·min－1離 心5min，PBS緩沖液重懸，平板計數(shù)法測定細菌數(shù)目，稀釋定量至2×1013L－1后，對各組小鼠進行攻毒試驗，每只小鼠腹腔注射300μL細菌，即每只小鼠6×1010CFU［11］，觀察14d，記錄各組小鼠死亡數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠血清特異性抗體效價以表示，組間比較采用配對t檢驗；攻毒保護率組間比較采用Fisher精確概率法。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒載體酶切鑒定 pUC57－HBc－IsdB50－285質(zhì)粒采用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得片段長度約為2700bp和1140bp（圖2）；pET28－HBc－IsdB50－285質(zhì)粒采用XhoⅠ 與XbaⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得片段長度約為1180bp和5200bp（圖3），結(jié)果與預(yù)期一致。

圖2 pUC57－HBc－IsdB50－285經(jīng) NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定電泳圖Fig.2 Electrophoregram of pUC57－HBc－IsdB50－285digested by NcoⅠand XhoⅠrestriction enzyme

圖3 pET28－HBc－IsdB50－285經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定電泳圖Fig.3 Electrophoregram of pET28－HBc－IsdB50－285digested by XhoⅠand XbaⅠrestriction enzyme

2.2 重組蛋白和純化蛋白產(chǎn)物的鑒定 HBc－IsdB50－285表達產(chǎn)物全菌體和超聲破碎上清經(jīng)SDS－PAGE分析，可見目標條帶在相對分子質(zhì)量44000處存在差異，且目的蛋白部分可溶，存在于表達上清。純化蛋白經(jīng)12%SDS－PAGE分析，在相對分子質(zhì)量44000處可見清晰單一條帶（圖4），純度約為90%，濃縮后蛋白表達水平為1.0g·L－1。

2.3 各組小鼠體內(nèi)特異性抗體滴度的效價值 間接ELISA法檢測小鼠血清特異性IgG，采用rIsdB作為包被抗原在20d檢測免疫小鼠IgG效價顯示：rIsdB添加佐劑組小鼠血清特異性抗體滴度的效價值高于 HBc－IsdB50－285添加佐劑組（P＜0.01），見表1。采用 HBc－IsdB50－285作為包被抗原在20d檢測IgG效價顯示：HBc－IsdB50－285添加佐劑組小鼠血清特異性抗體滴度的效價值高于rIsdB添加佐劑組和HBc－IsdB50－285組（P＜0.01）。見表2。

圖4 重組蛋白和純化蛋白SDS－PAGE電泳圖Fig.4 SDS－PAGE electrophoregram of recombinant and purified proteins

表1 rIsdB作為包被抗原時各組小鼠血清特異性抗體滴度的效價值Tab.1 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when rIsdB being regarded as coating antigen（n＝10，）

表1 rIsdB作為包被抗原時各組小鼠血清特異性抗體滴度的效價值Tab.1 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when rIsdB being regarded as coating antigen（n＝10，）

＊P＜0.01 vs rIsdB＋adjuvant group.

Group Value of antibody 11 20 rIsdB＋adjuvant 1760±876 titer（t／d）7680±2861 HBc－IsdB50－285＋adjuvant 400±129＊ 2240±876＊HBc－IsdB50－285 320±109＊ 1600±979＊PBS 0＊ 0＊

表2 HBc－IsdB50－285作為包被抗原時各組小鼠血清特異性抗體滴度的效價值Tab.2 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when HBc－IsdB50－285being regarded as coating antigen （n＝10，）

表2 HBc－IsdB50－285作為包被抗原時各組小鼠血清特異性抗體滴度的效價值Tab.2 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when HBc－IsdB50－285being regarded as coating antigen （n＝10，）

＊P＜0.05 vs rIsdB＋adjuvant group；△P＜0.05 vs HBc－IsdB50－285＋adjuvant group.

Group Value of antibodytiter（t／d） 11 20 rIsdB＋adjuvant 640±219 3200±1960 HBc－IsdB50－285＋adjuvant 2720±2234＊17920±7011 HBc－IsdB50－285 1920±1213＊7040±3505＊△PBS 0＊△ 0＊△

2.4 各組小鼠攻毒實驗 各組小鼠在初次免疫后21d的攻毒實驗：HBc－IsdB50－285添加佐劑組小鼠對金黃色葡萄球菌免疫保護率（60%）低于rIsdB添加佐劑組（70%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。HBc－IsdB50－285添加佐劑組小鼠對金黃色葡萄球菌免疫保護率與 HBc－IsdB50－285未添加佐劑組（40%）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與PBS組（0%）比較，HBc－IsdB50－285添加佐劑組小鼠對金黃色葡萄球菌攻毒保護率升高（P＜0.01），HBc－IsdB50－285未添加佐劑組小鼠對金黃色葡萄球菌攻毒保護率亦升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 金黃色葡萄球菌攻毒后各組小鼠生存曲線Fig.5 Survival curves of mice after S.aureus challenge in various groups

3 討 論

隨著耐藥性金黃色葡萄球菌在感染性疾病中比例的不斷攀升及抗生素使用不當，使金黃色葡萄球菌感染的治療面臨巨大困難?？茖W(xué)家們試圖通過使用疫苗療法預(yù)防金黃色葡萄球菌感染，根據(jù)臨床分離株所提供的相關(guān)信息，設(shè)計出了與金黃色葡萄球菌相關(guān)的多糖蛋白結(jié)合疫苗、蛋白亞單位疫苗和核酸疫苗等，但與金黃色葡萄球菌疫苗有關(guān)的臨床試驗均未成功［12］，這一結(jié)果對疫苗的設(shè)計及抗原的選擇提出了更苛刻的要求。

IsdB與金黃色葡萄球菌鐵代謝相關(guān)，在多種類金黃色葡萄球菌中高度保守，最早應(yīng)用于疫苗抗原是因為IsdB能夠與受感染者血清發(fā)生高度特異性結(jié)合［13］。利用IsdB免疫能提高小鼠對金黃色葡萄球菌攻毒的存活率，由90μg IsdB聯(lián)合鋁佐劑制備的人用金黃色葡萄球菌疫苗在進行到Ⅱ期臨床試驗時未獲成功，具體原因尚不清楚［14］。本文作者嘗試改進抗原結(jié)構(gòu)，使用IsdB表位（含部分氨基酸序列）結(jié)合到HBc免疫顯性區(qū)。HBc載體本身具有輔助性淋巴細胞（Th）表位，其可以幫助提高體液免疫應(yīng)答效果，同時HBc能夠?qū)⑼庠幢砦徽故居谄渌纬傻牡鞍最w粒的表面，利于抗原在細胞內(nèi)的加工呈遞［15］。HBc能夠攜帶外源片段最小可以是15氨基酸的B細胞線性表位，最大也可以達到258氨基酸的綠色熒光蛋白片段，超出這一范圍會影響HBc的組裝及免疫原性［16］。采用分子生物學(xué)技術(shù)將HBc與IsdB50－285基因融合并在大腸桿菌中表達，在目的蛋白的C末端引入組氨酸標簽，大大提高了蛋白的純化效率，盡管可以出現(xiàn)抗組氨酸標簽的抗體，但是對總體的免疫效果影響有限，如果免疫效果較好，可以進一步通過實驗去掉純化標簽［17］。本研究采用弗氏佐劑提高免疫效果，下一步實驗可以更換人體常用的鋁佐劑來進行體內(nèi)實驗。本研究選擇rIsdB作為陽性對照，其與HBc－IsdB50－285免疫保護效果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是兩者與陰性對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明 HBc－IsdB50－285結(jié)合佐劑使用具有良好的免疫原性。本研究所制備的融合蛋白對小鼠的免疫保護效果盡管未達到100%，但也為HBc載體在金黃色葡萄球菌疫苗中的應(yīng)用提供了參考，本課題組可以進一步從金黃色葡萄球菌其他抗原中選取適合的抗原表位與IsdB表位聯(lián)合使用，制備含有多種抗原表位的聯(lián)合疫苗，進而提高免疫保護效果。

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