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    p-Tau蛋白在抑郁癥大鼠海馬組織中的表達(dá)

    2015-11-29 04:52:42隋竹欣王海濤
    關(guān)鍵詞:海馬實(shí)驗(yàn)模型

    隋竹欣,李 珍,劉 昊,袁 楊,王海濤

    (1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系,河北 唐山 063000;2.山東萬杰醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系,山東 淄博 255000;河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 唐山 063000)

    世界衛(wèi)生組織調(diào)查[1]表明:至2020年,抑郁癥將會(huì)成為最重要的引起人類殘疾的疾病。近年研究[2]顯示:抑郁癥患者海馬部位的神經(jīng)元存在可塑性變化,海馬參與情緒的控制和反應(yīng),對(duì)情緒反應(yīng)起非特異性抑制作用,是極其重要的情緒整合區(qū)。微管相關(guān)蛋白Tau是一種大腦磷酸化蛋白質(zhì),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持微管功能方面有重要作用,多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病均出現(xiàn)了與Tau蛋白相關(guān)的特征性病理改變,Tau蛋白的過度磷酸化參與了多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生過程[3],其在抑郁癥發(fā)病過程中的作用尚未見詳細(xì)報(bào)道。本研究建立了大鼠抑郁癥模型,對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),尼氏染色觀察造模前后大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化,Western blotting法檢測(cè)磷酸化Tau(p-Tau)蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平,初步探討抑郁癥發(fā)病過程中海馬體積異常的原因,為進(jìn)一步研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 健康成年雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量160~180g(河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK京2009-0004),適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后用于實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件:22℃~25℃、晝夜節(jié)律(12h/12h)、自由飲水進(jìn)食。p-Tau兔多克隆抗體、β-actin小鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,免疫印跡相關(guān)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

    1.2 動(dòng)物分組及模型建立 將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,每組20只。模型組大鼠給予慢性不可預(yù)見性溫和刺激(chronic unpredicted mild stress,CUMS)建立模型。刺激包括11種:行為限制24h、鼠籠45℃傾斜24h、潮濕墊料24h、4℃冰水游泳5min、禁食24h、42℃熱水游泳5min、禁水24h、雙耳電擊5s2次(0.8mA)、夾尾1min、鼠籠搖動(dòng)15min和持續(xù)光照24h。以上11種應(yīng)激隨機(jī)分配,每天給予大鼠1種應(yīng)激,同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn),共計(jì)2輪。對(duì)照組大鼠除每天抓取1次外,不做特殊處理。在應(yīng)激結(jié)束后分別于1、7、14和28d處死大鼠用于實(shí)驗(yàn),對(duì)照組大鼠處死時(shí)間和模型組相同。

    1.3 大鼠行為學(xué)檢測(cè) ① 糖水偏好實(shí)驗(yàn):禁水禁食24h后,每籠放置2個(gè)完全相同水瓶,1%糖水和純凈水各200mL雙瓶共飲,測(cè)量1h內(nèi)糖水和普通水消耗量,計(jì)算大鼠的糖水偏好率:糖水偏好率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%;② 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)時(shí)每次將1只大鼠放入曠場(chǎng)中心方格內(nèi),通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試,測(cè)試內(nèi)容包括行走總路程、中央活動(dòng)時(shí)間、站立次數(shù)和修飾行為次數(shù);③ Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):連續(xù)測(cè)試3d,每天6個(gè)循環(huán),記錄在60s內(nèi)尋找水平面下平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期。取3d測(cè)試成績(jī)計(jì)為其空間記憶成績(jī)。

    1.4 尼氏染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài) 模型組大鼠應(yīng)激結(jié)束后第1天進(jìn)行取材,將大鼠腦組織冠狀切面石蠟包埋,4μm切片,切片脫蠟至水,用尼氏染料浸染20~30min,充分水洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,觀察大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

    1.5 Western blotting法檢測(cè)大鼠海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)水平 將大鼠直接斷頭取腦,冰上迅速分離海馬,用蛋白裂解液和酶抑制劑提取組織總蛋白。通過BCA定量后按照40μg蛋白量上樣進(jìn)行10聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,之后進(jìn)行電轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%BSA封閉2h,一抗p-MAP2兔多克隆抗體(1∶1000)4℃冰箱孵育過夜,羊抗兔二抗IgG(1∶5000)室溫孵育2h,ECL顯色。內(nèi)參照β-actin用同樣方法進(jìn)行Western blotting分析。以目的條帶與內(nèi)參照的吸光度(A)比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示,組間比較采用t檢驗(yàn);不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬p-Tau蛋白表達(dá)水平以表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較,模型組大鼠普通水消耗量無明顯變化(P>0.05),糖水消耗量和糖水偏好百分比明顯降低(P<0.01)。見表1。

    表1 2組大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of sucrose preference test of rats in two group (n=20,)

    表1 2組大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of sucrose preference test of rats in two group (n=20,)

    *P<0.01 vs control group.

    Group Water consumption(V/mL)Sucrose consumption(V/mL)Percentage of sucrose preference(η/%)Control 16.60±2.0742.80±8.2271.20±5.26 Model 18.81±2.3828.00±3.16*59.00±2.82*

    2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較,模型組大鼠行走總路程、中央活動(dòng)時(shí)間、直立次數(shù)和修飾行為次數(shù)減少(P<0.01),平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。見表2和圖1。

    表2 2組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of open field test and Morris water maze of rats in two groups (n=20,)

    表2 2組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of open field test and Morris water maze of rats in two groups (n=20,)

    *P<0.01 vs control group.

    Group Overall walking distance(l/m)Central activity time(t/s)Up-right times Grooming behavior Average escape latent period(t/s)Control 62.02±7.66 30.70±6.21 18.40±2.36 12.20±1.68 8.99±1.28 Model 41.62±5.11* 16.90±4.17* 10.20±2.65* 6.00±1.88* 21.53±2.58*

    圖1 2組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡圖Fig.1 Locus diagram of open field test and Morris water maze of rats in two groups

    2.3 大鼠海馬細(xì)胞形態(tài)學(xué) 尼氏染色,對(duì)照組大鼠海馬細(xì)胞密度大,錐體細(xì)胞層厚,排列親密整齊,胞體飽滿,突起明顯。模型組大鼠海馬細(xì)胞密度小,錐體細(xì)胞層變薄,細(xì)胞間隙大,排列疏松,細(xì)胞核萎縮,突起減少。見圖2(插頁二)。

    2.4 各組大鼠海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)水平對(duì)照組大鼠海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)水平為(0.50±0.01),模型組大鼠1、7、14和28d海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)水平分別為0.20±0.01、0.77±0.01、1.20±0.04和0.68±0.04。模型組大鼠CUMS后1d,海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)水平表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01);7d后開始高于對(duì)照組(P<0.05);14d明顯高于對(duì)照組(P<0.01);28d仍略高于對(duì)照組(P<0.05)。各組大鼠海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)見圖3。

    圖3 2組大鼠海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of p-Tau protein in hippocampus tissue of rats in two groups

    3 討 論

    抑郁癥發(fā)病率高,發(fā)病年齡寬泛,已嚴(yán)重影響人們的身心健康。動(dòng)物模型的成功建立促進(jìn)了抑郁癥的基礎(chǔ)研究。本研究結(jié)果表明:應(yīng)激后大鼠的糖水消耗量和糖水偏好百分比低于對(duì)照組,模型組大鼠CUMS后表現(xiàn)出明顯的 “快感缺失”癥狀;曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:應(yīng)激后大鼠在新異環(huán)境中自主行為、探究行為明顯減少;Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:大鼠空間記憶力減退。由此可見CUMS能使大鼠出現(xiàn)愉快感減退,自主探究減少,精神意志運(yùn)動(dòng)遲滯等抑郁癥狀,可以應(yīng)用于抑郁癥的基礎(chǔ)研究。這與本課題組前期研究[4]結(jié)果一致。

    既往研究顯示:不論是抑郁癥動(dòng)物模型[5]還是抑郁癥患者[6-10],均表現(xiàn)出海馬結(jié)構(gòu)的異常變化。本研究結(jié)果提示應(yīng)激后大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變。海馬參與情緒的控制和反應(yīng),是極其重要的情緒整合區(qū)。近年研究[11-12]顯示:抑郁癥患者海馬部位的神經(jīng)元存在可塑性變化,海馬神經(jīng)可塑性改變是抑郁癥的病理生理學(xué)特點(diǎn)之一。Tau蛋白是一種含磷糖蛋白,主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元軸突和胞漿內(nèi),參與維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞有絲分裂等過程,其磷酸化程度與神經(jīng)元的可塑性有關(guān)[13]。當(dāng)Tau蛋白發(fā)生高度磷酸化時(shí),可破壞Tau蛋白同微管的結(jié)合能力,從而影響細(xì)胞骨架系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[14]。研究[15]表明:在神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)與Tau蛋白異常磷酸化有密切的關(guān)系。為研究抑郁癥發(fā)病中海馬神經(jīng)細(xì)胞是否存在Tau蛋白磷酸化異常,本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡方法檢測(cè)抑郁癥大鼠海馬組織中p-Tau表達(dá)水平結(jié)果顯示:大鼠海馬組織中p-Tau蛋白表達(dá)水平在應(yīng)激結(jié)束后1d顯著低于對(duì)照組,而7d后高于對(duì)照組,14d達(dá)到高峰,28d回落但依舊高于對(duì)照組,提示應(yīng)激可以導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化增高。p-Tau蛋白影響神經(jīng)細(xì)胞的骨架系統(tǒng),導(dǎo)致細(xì)胞損傷死亡,這可能是導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮的原因之一。本課題組前期研究[16]結(jié)果證實(shí):抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加,可能與Tau蛋白磷酸化增高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示:應(yīng)激后1d,大鼠海馬p-Tau蛋白表達(dá)水平降低,但很快就表現(xiàn)出升高,其詳細(xì)機(jī)制有待深入研究探討。

    綜上所述,抑郁癥大鼠海馬結(jié)構(gòu)異??赡芘cTau蛋白磷酸化異常有關(guān),其具體機(jī)制在后期的工作中有待于進(jìn)一步深入研究。

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