硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌組織中MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)及心肌纖維化的影響及其機(jī)制

褚 春，曾 歐，羅 健，李 芳，肖 婷，周松柏，楊 軍

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng)421001，2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DC）作為糖尿?。╠iabetes melltus，DM）一種獨(dú)立心血管并發(fā)癥，目前日益受到重視，但其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。有研究［1］顯示：DC的發(fā)生發(fā)展與心肌纖維化有密切關(guān)聯(lián)。目前研究［2］顯示：DM心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）／基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）的調(diào)控紊亂有關(guān)聯(lián)，但其中內(nèi)在機(jī)制目前尚不清楚。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1（membranetype 1matrixmetallo－proteinase，MT1－MMP）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的新成員，可降解各種細(xì)胞間質(zhì)大分子，活化proMMP－2和MMP－13促進(jìn)細(xì)胞遷移等［3－6］。MT1－MMP作為一種細(xì)胞周圍微環(huán)境的調(diào)節(jié)因子，可修飾細(xì)胞外環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)或黏附分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變，故在腫瘤轉(zhuǎn)移、器官纖維化和結(jié)構(gòu)重構(gòu)中起重要作用［8－10］。MT1－MMP在心肌纖維化過(guò)程中起重要作用，但MT1－MMP在DM心肌纖維化中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。硫化氫（H2S）作為一種新發(fā)現(xiàn)的氣體信號(hào)分子，已有研究［7］顯示：其在心血管系統(tǒng)具有多種生物學(xué)效應(yīng)和心臟保護(hù)作用。而H2S是否參與糖尿病心肌纖維化以及信號(hào)調(diào)控機(jī)制，目前尚不清楚。TIMP是MMPs內(nèi)源性特異性抑制因子，與MMPs激活和活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。有研究［11］顯示：H2S參與MMPs／TIMPs的調(diào)控，但對(duì)DM大鼠心肌組織中MT1－MMP／TIMP－2的調(diào)控尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立DM大鼠模型，觀察氣體信號(hào)分子H2S對(duì)DM大鼠心肌纖維化以及MT1－MMP蛋白表達(dá)和MT1－MMP／TIMP－2失調(diào)的影響，探討H2S 在DM心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 成年清潔級(jí)雄性SD大鼠52只，體質(zhì)量（280±40）g，購(gòu)自南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（湘）2010－0006，分籠飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室恒溫（23±1℃）環(huán)境中，人工照明，白天黑夜各12h，所有大鼠均可自由獲得水和食物。兔源 MT1－MMP、TIMP－2一抗、兔源Ⅲ型膠原蛋白和GAPDH一抗購(gòu)于中國(guó)博士德公司；硫氫化鈉（NaHS）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液購(gòu)于中國(guó)碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及DM模型建立 52只SD大鼠飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組、DM組、H2S干預(yù)糖尿病組（DM＋H2S組）和H2S干預(yù)組（H2S組），每組13只。DM＋H2S組與DM組大鼠按體質(zhì)量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）40mol·kg－1；注射后24h內(nèi)給予5%葡萄糖水防止大鼠發(fā)生低血糖休克；注射72h后，尾靜脈采血測(cè)血糖水平，血糖水平大于16.7mmol·L－1提示造模成功。大鼠在造模后至處死前均有死亡，且集中在造模后2周內(nèi)，各組死亡數(shù)量不等，共死亡大鼠12只，至8周末各組大鼠總生存率為77%（40／52）。造模結(jié)束后，對(duì)照組、DM組、DM＋H2S組和H2S組剩余實(shí)驗(yàn)大鼠分別為12、9、9和10只。對(duì)照組大鼠精神狀反應(yīng)敏捷，毛色白而光澤。DM大鼠出現(xiàn)不同程度的多食、多尿、多飲和消瘦等癥狀，反應(yīng)遲鈍，皮毛無(wú)光澤。造模成功后，H2S組和DM＋H2S組大鼠每天腹腔注射NaHS溶液（100μmol·kg－1）；而對(duì)照組和DM組大鼠每天腹腔注射等量的生理鹽水，持續(xù)8周。

1.3 van Gieson（VG）染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài) 將大鼠斷頸處死，取4組大鼠左心室心肌組織，于常規(guī)10%甲醛溶液中固定，經(jīng)逐級(jí)脫水、浸蠟、包埋、切片，行VG染色，100倍光鏡下觀察大鼠心肌結(jié)構(gòu)及纖維化程度。

1.4 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白、MT1－MMP和TIMP－2蛋白的表達(dá)水平 取4組大鼠新鮮左心室心肌組織，提取蛋白后采用BCA比色法進(jìn)行定量。蛋白經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法將轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%BSA封閉2h后，以Ⅲ型膠原和GAPDH一抗（稀釋度均為1∶400）37℃孵育1h后4℃過(guò)夜，用TBST洗膜，以HRP標(biāo)記的二抗（稀釋度為1∶4000）37℃孵育1h，再次洗膜后以ECL顯色，曝光掃描后以圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。以目的條帶與GAPDH的灰度比值分別表示Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平。取4組大鼠心肌組織，以MT1－MMP、TIMP－2和GAPDH一抗（稀釋度均為1∶400），37℃孵育1h或4℃過(guò)夜，TBST洗膜；以HRP標(biāo)記的二抗（稀釋度為1∶2000）37℃孵育1h，洗滌和顯影后行灰度掃描，GAPDH作為內(nèi)參，以目的條帶與GAPDH的灰度比值分別表示 MT1－MMP和TIMP－2的蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原、MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)水平以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué) 光鏡下觀察VG染色的心肌組織切片，膠原纖維呈紅色。對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密整齊，心肌組織血管周圍及肌間隙中僅有少量膠原沉積；H2S組與對(duì)照組大鼠鏡下表現(xiàn)類似。DM組大鼠心肌細(xì)胞排列疏散紊亂，心肌組織血管周圍膠原沉積較對(duì)照組增多，且向周圍間質(zhì)延伸，間質(zhì)可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；DM＋H2S組大鼠心肌壁內(nèi)血管周圍膠原沉積較DM組明顯減少。見(jiàn)圖1（插頁(yè)二）。

2.2 各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原纖維蛋白的表達(dá)水平 與對(duì)照組（0.9644±0.0176）比較，DM組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平（1.1875±0.0407）明顯升高（P＜0.05）； 而DM＋H2S組大鼠心肌組織中的Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平（0.9999±0.0152）低于 DM組（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，H2S組大鼠心肌組織中Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平（0.9644±0.1777）無(wú)明顯變化（P＞0.05）。各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)電泳圖見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of typeⅢ collagen protein in myocardium tissue of rats in various groups

2.3 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，STZ組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與STZ組比較，STZ＋H2S組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）。H2S組和對(duì)照組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3和表1。

圖3 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP（A）和TIMP－2（B）蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of MT1－MMP（A）and TIMP－2（B）proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討 論

在諸多DM慢性并發(fā)癥中，DC具有極大的危害性，而其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制與心肌纖維化有關(guān)聯(lián)［1－2，12］。心肌纖維化不僅是 DC 心肌重構(gòu)的主要標(biāo)志，也是導(dǎo)致左心功能障礙的主要原因。DM心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但有研究［1－2，13］顯示其發(fā)生發(fā)展與MMPs／TIMPs的失調(diào)有關(guān)。MMPs是一大類結(jié)構(gòu)上具有很大同源性的鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，能有效降解細(xì)胞間質(zhì)蛋白質(zhì)。MT1－MMP是一種表達(dá)在細(xì)胞膜上的特殊類型的MMP，屬于膜型MMPs，其可作用于多種細(xì)胞外基質(zhì)成分和細(xì)胞黏附分子，參與許多重要的生理和病理過(guò)程，尤其是組織重構(gòu)［3］。MT1－MMP的底物有細(xì)胞間質(zhì)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原和蛋白多糖、層黏蛋白及纖維連結(jié)蛋白等，除直接降解細(xì)胞間質(zhì)成分外，MT1－MMP在羧基末端還有一跨膜結(jié)構(gòu)域，可啟動(dòng)細(xì)胞表面多個(gè)蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此MT－MMPs的表達(dá)增加可觸發(fā)瀑布式的MMPs，如MMP－9和MMP－2等激活過(guò)程，并進(jìn)一步促使細(xì)胞間質(zhì)蛋白的降解。有研究［4－5］顯示：在 MMPs由酶原向活性形式轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，MT1－MMP起重要的激活作用，故MT1－MMP可通過(guò)直接和間接作用參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解與改建，在腫瘤遷移和纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示：正常大鼠心肌組織中，MT1－MMP蛋白有一定表達(dá)，但在DM大鼠心肌組織中，MT1－MMP蛋白表達(dá)水平則明顯上升，與此同時(shí)心肌組織存在明顯間質(zhì)纖維化，Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平也明顯升高，提示MT1－MMP表達(dá)水平的上調(diào)可能參與了DM心肌纖維化的發(fā)生。

表1 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of MT1－MMP and TIMP－2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（）

表1 各組大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of MT1－MMP and TIMP－2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs DM group.

Group n MT1－MM2 TIMP－2 Control 121.0178±0.00890.9555±0.0086 DM 91.3489±0.0265＊1.3050±0.0084＊DM＋H2S 91.1671±0.0168△0.8035±0.1324△H2S 101.0414±0.01010.8166±0.0127

當(dāng)TIMP－2的分子數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò) MMPs時(shí)，可與活化的MMPs以1∶1比例結(jié)合，并抑制其活性，故兩者的平衡對(duì)維持正常的膠原代謝具有重要意義，也決定著細(xì)胞間基質(zhì)的降解和重建［13－14］。TIMPs家族中TIMP－2對(duì)MMPs的抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)MMPs被激活的同時(shí)，TIMP通常也被激活，已有研究［15］顯示：DM 大鼠心肌纖維化過(guò)程中TIMP－2表達(dá)水平明顯升高。本研究結(jié)果顯示：DM大鼠心肌組織中TIMP－2表達(dá)水平升高，這可能與MMPs的激活以及細(xì)胞間質(zhì)降解產(chǎn)物的刺激有關(guān)。MT1－MMP／TIMPs的表達(dá)水平正常應(yīng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從而調(diào)控細(xì)胞外間質(zhì)和膠原蛋白的降解和產(chǎn)生。一旦平衡被破壞，MT1－MMP活性增強(qiáng)可引起膠原降解和變性，從而導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化。H2S作為新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，參與多種生物學(xué)效應(yīng)及心血管調(diào)節(jié)作用，尤其是心肌重構(gòu)［6］。本研究結(jié)果顯示：H2S干預(yù)后DM大鼠心肌纖維化明顯改善，Ⅲ型膠原表達(dá)也明顯下調(diào)，提示H2S的干預(yù)可改善DM大鼠的心肌間質(zhì)纖維化；與DM組比較，DM＋H2S組大鼠心肌組織中 MT1－MMP蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，TIMP－2蛋白的表達(dá)水平亦下調(diào)，提示H2S可能通過(guò)下調(diào) MT1－MMP和TIMP－2表達(dá)水平以及糾正MT1－MMP／TIMP－2表達(dá)失衡，進(jìn)而減輕 DM 大鼠的心肌纖維化。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于H2S下調(diào)DM大鼠心肌組織中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表達(dá)水平的報(bào)道，但已有學(xué)者［11，16］發(fā)現(xiàn)：H2S可下調(diào)肝癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中MMP－9和MMP－2蛋白的表達(dá)水平，并抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。MT1－MMP通過(guò)降解細(xì)胞間質(zhì)以及激活其他MMPs參與纖維化進(jìn)程，并與心肌纖維化發(fā)生發(fā)展有關(guān)［17－20］。H2S改善DM 心肌纖維化的機(jī)制可能與下調(diào)MT1－MMP表達(dá)以及維持MT1－MMP／TIMPs平衡有關(guān)，但其中的具體信號(hào)機(jī)制和應(yīng)用前景仍有待深入研究。

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