Wnt／β－catenin通路關(guān)鍵分子在NK／T細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義

秦貝貝，李亞青，李小麗，路禮莎，張旭東，張明智

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院淋巴瘤診療中心，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室，河南 鄭州 450052）

NK／T 細(xì)胞淋巴瘤（NK／T cell lymphoma，NKTCL）是非霍奇金淋巴瘤的一個亞型，其在亞洲和拉丁美洲發(fā)病率明顯高于歐美國家。NKTCL的病理特征為血管中心性浸潤與破壞，常伴明顯的組織壞死，具有高度侵襲性、化療不敏感和預(yù)后差的特點［1］。Wnt／β－catenin信號通路調(diào)控細(xì)胞生長增殖及凋亡等過程，其異常持續(xù)性激活參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移［2］。已有研究［3－5］證實：該通路在結(jié)直腸癌、乳腺癌、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和白血病中有異常激活，但其在NKTCL中的作用鮮有報道。本研究擬分析 Wnt／β－catenin信號通路中關(guān)鍵分子β－catenin、c－myc和cyclinD1在NKTCL細(xì)胞株SNK－6、YTS 及NKTCL組織中的表達(dá)情況，并將其與NKTCL患者臨床特征和預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討Wnt／β－catenin信號通路在NKTCL發(fā)病過程中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月—2013年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科病理明確診斷為NKTCL的石蠟包埋組織50例，其中男性32例，女性18例，年齡15～75歲，平均年齡46歲，病變均位于鼻腔。取同期的20例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織作為對照，男性12例，女性8例，年齡17～62歲，平均年齡40歲。NKTCL診斷依照2008年WHO標(biāo)準(zhǔn)：病理改變?yōu)榱黾?xì)胞血管中心性浸潤并破壞血管，瘤細(xì)胞具有NK細(xì)胞表型或毒性T細(xì)胞表型以及細(xì)胞毒表型并與EB病毒感染密切相關(guān)。臨床分期按照Ann Arbor分期，其中Ⅰ期5例，Ⅱ期29例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例。所有患者均未做過放療和化療，入院后行放療、化療或綜合治療。每例患者均登記臨床資料，隨訪采用電話、查閱病案資料等方法，隨訪截止至2014年2月，生存期以確診至死亡時間（完全數(shù)據(jù)）或至隨訪截止時間（截斷數(shù)據(jù)）計算。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購自Solarbio生物醫(yī)藥公司；無支原體胎牛血清購自杭州四季青公司；總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas生物有限公司；SYBR Green Mixture購自北京康為世紀(jì)生物公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；兔抗人β－catenin、c－myc單克隆抗體、免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SNK－6和YTS細(xì)胞株為本實驗室長期保存。用含1000U·mL－1白細(xì)胞介素2（IL－2）、1%非必需氨基酸和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，每2～3d傳代1次，選取對數(shù)生長期細(xì)胞備用。

1.4 細(xì)胞系總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，Trizol法提取RNA，經(jīng)RNA純度檢測A260／A280均在1.80～2.00。參照 Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Real－time PCR法檢測SNK－6、YTS和正常NK細(xì)胞中β－catenin、c－myc及cyclinD1mRNA 的相對表達(dá)水平 PCR反應(yīng)體系：采用25μL體系，模板2.0μL，上、下游引物混均后取2.0μL，SYBR熒光酶12.5μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃、10min，變性95℃、15s，變性／延伸 60℃、1min，共40個循環(huán)，最后延伸8min。同時以正常NK細(xì)胞作為對照，實驗設(shè)置3個副孔且重復(fù)3次。采用ABI Prism 7500SDS Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，mRNA相對表達(dá)水平＝ 2－ΔΔCt，ΔΔCt＝ΔCt細(xì)胞株－ΔCt正常NK＝（Ct細(xì)胞株－Ctβ－actin）－（Ct正常NK－Ctβ－actin）。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

1.6 免疫組織化學(xué)SP法檢測NKTCL組織和反應(yīng)性增生的淋巴組織中β－catenin、c－myc蛋白的表達(dá) 調(diào)節(jié)SNK－6和YTS細(xì)胞濃度至1×106mL－1，細(xì)胞涂片（載玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理），室溫下自然晾干，置于4%多聚甲醛固定液中固定30min，放入0.5%Triton溶液中20min，PBS液沖洗后，室溫下自然涼干后4℃保存。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶及微波爐修復(fù)抗原后，PBS沖洗3次，每次3min，10%正常山羊血清室溫下孵育以減少背景非特異性染色，滴加一抗（1∶300稀釋），4℃過夜，PBS漂洗后滴加二抗，室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.7 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 在顯微鏡下隨機選擇10個高倍鏡視野（×400），每個視野計數(shù)100個細(xì)胞進(jìn)行觀察。β－catenin和c－myc均位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿，陽性染色呈棕黃色顆粒。根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)百分比評分。染色強度評分：無色或與背景均勻一致的淡黃色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分（細(xì)胞著色深淺需與同一切片背景著色對照）。陽性細(xì)胞數(shù)百分比評分：陰性為0分，小于10%為1分，10%～50%為2分，大于50%為3分。兩積分乘積：0分為陰性（－），1～3分為弱陽性（＋），4～6分為中等陽性（?），7～9分為強陽性（?）。所有染色結(jié)果由本院病理科2名醫(yī)生采用雙盲法判定，判斷不一致時再共同進(jìn)行觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。β－catenin、c－myc、cyclinD1mRNA 的相對表達(dá)水平以表示，組間比較采用t檢驗；β－catenin和c－myc表達(dá)陽性率組間比較采用χ2檢驗；β－catenin和c－myc蛋白表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析；β－catenin表達(dá)與NKTCL患者中位總生存期的關(guān)系分析采用Kaplan－Meier法。

2 結(jié) 果

2.1 NKTCL細(xì)胞株SNK－6和YTS中β－catenin、c－myc和cyclinD1mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞株SNK－6中β－catenin、c－myc和cyclinD1mRNA相對表達(dá)水平為 0.036±0.003、0.064±0.004和0.042±0.004，細(xì)胞株YTS中β－catenin、c－myc和cyclinD1mRNA 相對表達(dá)水平為0.022±0.002、0.040±0.003和0.035±0.004，其相對表達(dá)水平均高于正常 NK 細(xì)胞（0.010±0.002、0.026±0.003和0.008±0.001）（P＜0.05）。

2.2 NKTCL組織和反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織中β－catenin、c－myc和cyclinD1的表達(dá) β－catenin和c－myc均定位于細(xì)胞漿和（或細(xì)胞核）。在 YTS（圖1A和B，見插頁二）和SNK－6（圖1C和D，見插頁二）細(xì)胞中，β－catenin和c－myc均呈陽性表達(dá)，在正常NK細(xì)胞中則呈陰性表達(dá)（圖1E和F，見插頁二）。β－catenin在NKTCL組織中陽性表達(dá)率為24%（12／50），在20例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織中未見陽性表達(dá)（圖2A和B，見插頁二）。NKTCL組織中c－myc陽性表達(dá)率為56%（28／50），反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織中c－myc陽性表達(dá)率為25%（5／20）（圖2C和D，見插頁二）。NKTCL組織中β－catenin和c－myc的陽性表達(dá)率明顯高于反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織（P＜0.05）。

2.3 不同臨床特征NKTCL患者的β－catenin和c－myc蛋白表達(dá) β－catenin蛋白表達(dá)與 Ann Arbor分期有關(guān)聯(lián)（P＜0.05），c－myc蛋白表達(dá)與 Ann Arbor分期、Ki－67水平有關(guān)聯(lián)（P＜0.05），而二者表達(dá)與其他臨床指標(biāo)均無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。見表2。

2.4 NKTCL患者中β－catenin和c－myc表達(dá)的相關(guān)性 28例c－myc陽性表達(dá)的患者中β－catenin陽性表達(dá)有9例；22例c－myc陰性表達(dá)的患者中β－catenin陽性表達(dá)有3例。經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，β－catenin和c－myc在NKTCL患者中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.770，P＜0.05）。

表2 不同臨床病理特征NKTCL患者β－catenin和c－myc蛋白表達(dá)Tab.2 Expressions ofβ－catenin and c－myc proteins of NKTCL patients with different clinicopathological features

2.5 β－catenin表達(dá)與NKTCL患者中位總生存期的關(guān)系 50例NKTCL患者中，可隨訪者41例，存活25例，死亡16例，生存隨訪期為6～36個月，平均生存期為29.714個月（95%CI：26.606～32.823），β－catenin陽性表達(dá)患者平均生存期為（23.662±2.768）個月，β－catenin陰性表達(dá)患者平均生存期為（31.656±1.780）個月，經(jīng)Logrank檢驗，β－catenin表達(dá)陽性與陰性患者者平均生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5.193，P＜0.05）。見圖3。

3 討 論

Wnt信號通路與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。正常情況下，細(xì)胞膜表面和細(xì)胞膜下有極少量β－catenin參與細(xì)胞間黏附。Wnt信號通路激活時，異常積累的β－catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子或淋巴細(xì)胞增強因子結(jié)合，激活下游靶基因c－myc、cyclinD1的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移［6］。此外，β－catenin能誘導(dǎo)正常細(xì)胞向瘤性轉(zhuǎn)化，因此β－catenin被認(rèn)為是致癌基因［7］。

圖3 β－catenin表達(dá)與NKTCL患者總體生存期關(guān)系的Kaplan－Meier曲線Fig.3 Kaplan－Meier curves for relationship between expression ofβ－catenin and overall survival rate of NKTCL patients

麥玉潔等［8］在多種白血?。馨土黾?xì)胞株中檢測到β－catenin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平升高以及細(xì)胞核的異常定位，其過量表達(dá)提示W(wǎng)nt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在淋巴瘤細(xì)胞中有異常激活。Bellei等［9］研究發(fā)現(xiàn)：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者組織中的β－catenin存在mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平的升高，并與患者的臨床分期顯著相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：Wnt信號通路中關(guān)鍵組分β－catenin和下游靶基因c－myc、cyclinD1在SNK－6、YTS細(xì)胞和NKTCL組織中有不同程度表達(dá)，提示該通路可能在NKTCL組織中異常激活。c－myc基因?qū)儆谠┗?，?dāng)其表達(dá)增加時，可以刺激細(xì)胞增生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。在淋巴反應(yīng)性增生組織中亦檢測到c－myc的陽性表達(dá)，表明其并不是惡性腫瘤的特有標(biāo)志，只提示細(xì)胞增生的活躍程度。cyclinD1基因是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1期到S期的進(jìn)程［11］。β－catenin與c－myc的相關(guān)分析結(jié)果顯示：兩者存在一定的關(guān)聯(lián)，但并不是相互對應(yīng)，因此 Wnt／β－catenin只是參與NKTCL發(fā)生發(fā)展的信號通路之一［12］。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：β－catenin的表達(dá)與Ann Arbor分期有關(guān)聯(lián)，c－myc的表達(dá)與 Ann Arbor分期、Ki－67水平有關(guān)聯(lián)，二者與患者年齡、性別、IPI評分、LDH水平、EBER和療效等均無關(guān)聯(lián)。Kaplan－Meier法分析結(jié)果顯示：β－catenin陰性者比陽性者生存時間長，平均生存期分別約為31和23個月。

Wnt／β－catenin信號通路的異常激活，一定程度上促進(jìn)了NKTCL的發(fā)生發(fā)展，因此其有望成為監(jiān)測病情、評估預(yù)后的指標(biāo)。該通路中的重要位點已經(jīng)嘗試被用于靶向治療。抗真菌藥環(huán)吡酮胺和利尿藥依地尼酸可抑制經(jīng)典Wnt通路在淋巴瘤LY－8和Raji細(xì)胞中的激活，并可導(dǎo)致其細(xì)胞活性降低及細(xì)胞凋亡發(fā)生［13］。櫟精是黃酮類物質(zhì)的典型代表，可以通過降解β－catenin、抑制β－catenin與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子與特定基因位點的結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，經(jīng)櫟精處理后多種淋巴瘤細(xì)胞株可觀察到明顯的增殖抑制和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［14］。

NK／T細(xì)胞淋巴瘤是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤，其確切的發(fā)病機制尚未清楚［15］。Wnt通路在淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化以及在細(xì)胞黏附、極化和運動等方面發(fā)揮重要作用，但其與惡性淋巴瘤的發(fā)病、侵襲性及治療方案等關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示：Wnt通路中關(guān)鍵分子在NKTCL組織中高表達(dá)，提示該通路的異常激活可能在NKTCL的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，有利于進(jìn)一步闡明其發(fā)病機制，并獲得基于該通路的靶向治療的可能。

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