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    自噬在鎘致大鼠腎臟損傷中的作用

    2015-11-29 04:52:40秦永剛李晨旭王永杰盧日峰杜海英陳巾宇
    關(guān)鍵詞:中鎘染毒空白對照

    秦永剛,李晨旭,李 雷,王永杰,盧日峰,杜海英,陳巾宇,郭 麗

    (1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,吉林 長春 130021;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教學(xué)實驗中心,吉林 長春 130021;3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,吉林 長春 130021)

    鎘損傷是以腎臟和骨骼損傷為主要中毒表現(xiàn)的環(huán)境污染性疾病,目前關(guān)于鎘對于腎臟損傷機制的國內(nèi)外文獻中,其損傷機制經(jīng)證實涉及細胞凋亡、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化等[1-4]。作為細胞損傷的另一機制,自噬在腎臟損傷中起重要作用[5],但是自噬在鎘所致腎臟損傷中作用的研究較少;已有研究[6]僅以離體細胞作為研究對象研究了自噬在鎘造成的腎損傷中的作用,而在體內(nèi)實驗中,自噬在鎘所致腎損傷的作用未見報道。本研究擬利用不同濃度氯化鎘對Wistar大鼠染毒,制備鎘中毒腎損傷動物模型,觀察鎘對腎臟功能的影響,并對腎臟自噬指標進行檢測,探討自噬在鎘損傷中的作用,為臨床治療鎘中毒提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物和主要試劑 選取40只健康雄性Wistar成年大鼠,體質(zhì)量(240±20)g,購自吉林大學(xué)實驗動物中心,動物合格證號:SCXK-(吉)2008-0005;氯化鎘購自天津市復(fù)光科技有限公司,LC3B和Beclin1抗體購自美國Epitomics公司。

    1.2 動物分組及腎損傷模型制備 將40只大鼠隨機分為空白對照組、低劑量染毒組(0.2mg·kg-1CdCl2)、中劑量染毒組(0.4mg·kg-1CdCl2)和高劑量染毒組(0.8mg·kg-1CdCl2),每組10只。染毒組大鼠腹腔注射給予0.2、0.4和0.8mg·kg-1氯化鎘溶液制備損傷模型[7-8],空白對照組大鼠給予等量生理鹽水。連續(xù)染毒5周,期間大鼠自由飲水飲食,觀察大鼠一般狀況,并記錄大鼠體質(zhì)量變化。

    1.3 腎功能生化指標檢測 染毒5周后取各組大鼠全血,用全自動生化儀檢測各組大鼠血中肌酐、尿素氮和β2微球蛋白表達水平。

    1.4 原子吸收法測定大鼠腎臟組織中鎘水平 采用高氯酸與硝酸(1∶4混合)濕法消化大鼠腎臟,定容后采用原子吸收光譜儀測定大鼠腎臟組織中鎘水平。

    1.5 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達水平 石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水,枸櫞酸溶液98℃抗原修復(fù)5min,內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫25min,動物非免疫血清封閉30min,一抗Beclin1(1∶200稀釋)4℃過夜,生物素標記的二抗室溫40min,鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶30min,DAB顯色,蘇木精染核5min,弱氨水返藍,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。采用Image Pro Plus 6.0分析Beclin1積分吸光度(IA)值,以IA值表示Beclin1蛋白表達水平。

    1.6 Western blotting法檢測大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B相對表達水平 蛋白提取,制備15%分離膠、5%濃縮膠,在樣品孔中加入30μg蛋白樣品,80V電泳,100mA轉(zhuǎn)膜2h,一抗LC3B(1∶1000稀釋)4℃過夜,TBST室溫洗膜3次,HRP標記的二抗室溫45min,TBST室溫洗膜3次,暗室中加ECL發(fā)光液,曝光,顯影定影。采用Quantity One軟件對所得圖像進行灰度值分析,重復(fù)測量取均值。LC3B相對表達水平=LC3B灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組大鼠體質(zhì)量、血清肌酐、尿素氮、β2微球蛋白、組織中鎘水平、Beclin1蛋白表達水平值和LC3B相對表達水平以表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用SNK-q法。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠一般狀況和體質(zhì)量 染毒組大鼠在染毒開始后出現(xiàn)食量減少,精神狀態(tài)萎靡,毛色無光;第3周開始高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量明顯低于空白對照組(P<0.05);到第5周染毒結(jié)束,中劑量染毒組和高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量均顯著低于空白對照組(P<0.05)。見表1。

    表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats at different time points in various groups (n=10,,m/g)

    表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats at different time points in various groups (n=10,,m/g)

    *P<0.05compared with blank control group;△P<0.05compared with low dose group.

    0 3 4 5 Blank control 247.80±8.17 306.80±14.27 322.Group Body weight(week)60±22.67 339.40±15.68 CdCl2 Low dose 244.60±6.80 285.20±24.69 298.40±21.53 310.60±22.93 Middle dose 246.20±7.53 285.80±19.08 291.20±13.28 299.00±24.37*High dose 245.40±7.67 280.20±15.64* 284.60±19.37* 287.60±28.08*△

    2.2 各組大鼠腎功能生化指標 與空白對照組比較,低劑量染毒組大鼠生化指標表達水平改變不明顯,中、高劑量染毒組大鼠血清肌酐、尿素氮和β2微球蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與低劑量染毒組比較,高劑組染毒組大鼠尿素氮和中、高劑量組大鼠血清肌酐表達水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

    2.3 各組大鼠腎臟組織中鎘水平 空白對照組大鼠腎臟中僅見微量鎘蓄積,低、中和高劑量染毒組大鼠腎臟組織中均有鎘蓄積,且低、中、高劑量染毒組大鼠鎘的蓄積量呈遞增趨勢。與低劑量染毒組比較,中、高劑量染毒組大鼠腎臟組織中鎘水平顯著升高(P<0.05);與中劑量染毒組比較,高劑量染毒組大鼠腎臟組織中鎘水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

    2.4 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達水平 空白對照組大鼠腎臟組織基本不表達Beclin1,而染毒組大鼠隨著染毒劑量的增加腎臟組織Beclin1的表達水平也隨之增加。與空白對照組比較,低、中和高劑量染毒組大鼠腎臟組織中Beclin1表達水平明顯升高(P<0.05);中、高劑量染毒組大鼠腎臟組織中Beclin1表達水平顯著高于低劑量染毒組(P<0.05),同時高劑量染毒組大鼠腎臟組織中Beclin1表達水平顯著高于中劑量染毒組(P<0.05)。見表3和圖1(見插頁一)。

    表2 各組大鼠腎功能指標Tab.2 Renal function indexes of rats in various groups (n=10,)

    表2 各組大鼠腎功能指標Tab.2 Renal function indexes of rats in various groups (n=10,)

    *P<0.05compared with blank control group;△P<0.05compared with low dose group.

    Group BUN[cB/(mmol·L-1)] CR[cB/(μmol·L-1)] β2-MG[ρB/(mg·L-1)]Blank control 5.27±0.64 26.4±2.2 1.08±0.03 CdCl2 Low dose 5.63±0.91 26.6±3.1 1.12±0.04 Middle dose 6.51±0.51* 31.2±3.4*△ 1.18±0.06*High dose 6.85±0.91*△ 31.6±4.2*△ 1.17±0.08*

    表3 各組大鼠腎臟組織中鎘水平、Beclin1表達水平和LC3B相對表達水平Tab.3 Levels of cadmium,expression levels of Beclin1and relative expression levels of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups (n=10,)

    表3 各組大鼠腎臟組織中鎘水平、Beclin1表達水平和LC3B相對表達水平Tab.3 Levels of cadmium,expression levels of Beclin1and relative expression levels of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups (n=10,)

    *P<0.05compared with blank control group;△P<0.05compared with low dose group;#P<0.05compared with middle dose group.

    Relative expression level of LC3B Blank control 0.18±0.04 347.6±25.9 0.14±0.0 Group Level of cadmium[wB/(μg·g-1)]Expression level of Beclin1(IA)2 CdCl2 Low dose 25.95±2.90* 1641.9±221.8* 0.32±0.04*Middle dose 43.62±8.60*△ 18626.5±610.6*△ 0.69±0.07*△High dose 79.54±15.57*△# 36348.2±718.8*△# 0.83±0.08*△#

    2.5 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B的相對表達水平 低、中和高劑量染毒組LC3B相對表達水平均較空白對照組顯著增加(P<0.05),且中、高劑量染毒組大鼠腎臟組織中LC3B的相對表達水平較空白對照組、低劑量組顯著增加(P<0.05)。見表3和見圖2。

    圖2 Western blotting法檢測各組大鼠腎臟組織中LC3B表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

    3 討 論

    本研究結(jié)果表明:鎘染毒5周后,大鼠腎臟功能嚴重損傷,染毒組大鼠腎功能指標肌酐、尿素氮表達水平顯著增高,表明腎臟可能出現(xiàn)急慢性腎炎、重癥腎盂腎炎或各種原因?qū)е碌募甭阅I功能障礙;β2-微球蛋白表達水平升高,表明腎小管、腎小球可能出現(xiàn)功能性損傷。已有研究[9]表明:鎘在一定劑量內(nèi)即可對腎近端小管細胞造成明顯損傷,影響其正常功能;鎘也可對腎小體濾過屏障的超微結(jié)構(gòu)造成損傷[10],致使腎臟功能不全;申元帥[11]的研究結(jié)果也支持鎘對于腎臟功能的損傷作用,與本實驗的研究結(jié)果一致。

    自噬是一種降解胞質(zhì)材料和細胞器的溶酶體途徑,其在氨基酸饑餓、未折疊蛋白反應(yīng)和病毒感染等條件下均會被激活[12],以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[13]。已有研究證實自噬在腎臟損傷中扮演著重要的角色。Inoue等[14]在利用NRK-52E研究腎臟損傷過程中發(fā)現(xiàn):自噬參與了損傷細胞的死亡過程,因此可認為自噬可以作為腎臟細胞損傷的一種指標;而He等[15]認為:自噬可能通過促進腎小管的萎縮和分解來促進腎臟纖維化,也可能通過影響細胞內(nèi)過度膠原的降解來阻止腎臟纖維化;Wang等[16]發(fā)現(xiàn):在對 MES13細胞加入鎘作用后細胞自噬作用明顯增強,表明鎘對細胞自噬有誘導(dǎo)作用。在本實驗中染毒組大鼠腎臟組織中自噬蛋白LC3B及Beciln1表達水平顯著升高,而在未染毒大鼠腎臟中其表達水平極低,表明自噬在鎘對腎臟的損傷過程中起到了一定的作用。本研究結(jié)果表明:在該實驗染毒劑量內(nèi),腎臟組織中蓄積了大量鎘,且隨著染毒劑量增加,鎘的蓄積量也隨之增多,分析其機制可能是鎘被吸收轉(zhuǎn)運進入腎臟后,在腎臟中蓄積,損傷腎功能細胞,激活自噬機制,使細胞發(fā)生自噬性死亡。

    綜上所述,鎘中毒可導(dǎo)致腎臟組織嚴重損傷,影響腎臟功能,自噬可能是鎘致腎臟損傷的作用機制之一,但其具體機制仍需進一步探究。

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