臍血間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠輻射性肝損傷的作用

顏賀欣，蘇威，楊丹，高鵬，夏玉軍，單守勤

1.青島大學(xué)，山東 青島 266071；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.濟南軍區(qū) 第一療養(yǎng)院，山東青島 266071

伴隨科技的發(fā)展，核技術(shù)的廣泛應(yīng)用和放射醫(yī)學(xué)的發(fā)展，電離輻射對人類產(chǎn)生了不可避免的損傷。肝臟是輻射的敏感器官，其放射敏感性僅次于骨髓、淋巴、胃腸組織、性腺、胚胎和腎。輻射會造成肝臟形態(tài)、代謝功能、作用機制的改變，以及肝內(nèi)細(xì)胞的病理、生理、生物膜、酶活性和肝微循環(huán)等的改變[1]。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）是多能干細(xì)胞的一種，它具有分化度低、有絲分裂程度低、DNA分離不對稱[2]等特征，以及細(xì)胞更新、組織再生、免疫調(diào)節(jié)和多向分化的潛能[3]。應(yīng)用具有強大功能的UCMSC，在輻射性肝損傷的治療中取得很大的研究成果，是輻射醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中治療的理想種子。在本研究中，我們通過對小鼠全身進行X 線輻射，制作輻射損傷的模型，經(jīng)尾靜脈注射UCMSC 懸浮液后，檢測小鼠肝細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化及肝細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶的活性、丙二醛含量的改變，研究人UCMSC 對輻射性肝損傷的防護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

健康清潔級SD小鼠80只，體重（22±2）g，來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（DiL 標(biāo)記）來自清華大學(xué)深圳研究生院。測定超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物分組

將小鼠隨機分為4組，每組20只。除正常組外，采用醫(yī)用直線加速器產(chǎn)生的X線對其余各組小鼠進行全身照射，波源距皮膚100 cm，照射劑量2 Gy。照射完畢，隨機分組標(biāo)記，按如下分組，分別于小鼠尾靜脈注射1 mL 處于對數(shù)生長期的第3 代人UCMSC懸液或等體積的生理鹽水：

①正常組：不照射，12 和24 h 僅尾靜脈注射生理鹽水；②放射組：照射后12 和24 h 僅尾靜脈注射生理鹽水；③普通組：照射后12 和24 h 分別尾靜脈注射UCMSC 懸浮液和生理鹽水；④加強組：照射后12和24 h后分別尾靜脈注射UCMSC懸浮液。

1.3 肝組織勻漿的制備

無菌條件下取出肝組織，準(zhǔn)確稱取重量，按照重量（g）∶體積（mL）的比例加入9 倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，2500～3000 r/min 離心10分鐘，上清即為10%勻漿。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

觀察小鼠受輻射前后的活動量、精神狀態(tài)、食欲狀況，并記錄。

經(jīng)干預(yù)后處死小鼠，取小鼠肝臟，用4%甲醛固定做石蠟切片，經(jīng)石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色，觀察肝臟的病理形態(tài)變化。

取小鼠肝組織勻漿與檢測試劑按比例混合，漩渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻，測定D532nm值，計算樣品中MDA的含量。

取稀釋的小鼠肝組織勻漿與檢測試劑混合于96 孔酶標(biāo)板混勻，37℃孵育20 min，于酶標(biāo)儀上測定D550m值，計算樣品中SOD的活力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 輻射前后小鼠一般狀態(tài)的變化

與正常組小鼠比較，輻射后放射組的小鼠活動量明顯減少，精神較差，食欲減退。經(jīng)注射UCMSC懸浮液治療的小鼠與放射組小鼠比較，活動量有所增加，精神較好，食欲增強。

2.2 輻射前后小鼠肝臟組織的病理學(xué)形態(tài)改變

正常肝組織肝索排列有序，肝竇無充血和擴大，肝細(xì)胞無水腫變性和壞死，中央靜脈管壁完整，管腔無擴大、變窄阻塞，周圍無膠原纖維沉積（圖1A）。與正常組比較，放射組肝細(xì)胞有不同程度的水腫、變性，中央靜脈周圍明顯有炎性細(xì)胞浸潤，周圍網(wǎng)狀纖維增多，變窄、堵塞（圖1B）。與放射組比較，注射UCMSC 懸浮液治療的普通組小鼠肝小靜脈周圍網(wǎng)狀纖維減少，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤有所減輕，周圍網(wǎng)狀纖維減少；加強組中央靜脈管壁周圍膠原纖維沉積大幅減少（圖1C、D）。

2.3 輻射后小鼠肝臟SOD活力和MDA含量

圖1 各組小鼠肝組織的病理學(xué)形態(tài)

2.3.1 小鼠肝細(xì)胞中SOD的活性 輻射組與正常對照組比較，SOD 活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=41.89～182.96，t=10.79～22.03，*P＜0.01）。普通組與輻射組比較，SOD活性有所升高，有明顯的改善作用（F=41.89～182.96，t=4.78～13.12，**P＜0.01）。加強組與普通組比較，SOD 活性有所升高（F=41.89～182.96，t=1.68～10.15，***P＜0.05）。見表1、圖2。

2.3.2 小鼠肝細(xì)胞中MDA 的含量 輻射組與正常對照組比較，MDA 含量顯著升高（F=158.441～632.751，t=12.13～44.22，*P＜0.01）。普通組與輻射組比較，MDA 含量有所降低（F=158.441～632.751，t=5.44～15.00，**P＜0.01）。加強組與普通組比較，MDA含量降低（F=41.89～182.96，t=10.83～26.02，***P＜0.05）。見表2、圖3。

3 討論

電離輻射可使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生自由基，如超陰離子、羥自由基、過氧化氫等[4]。這些產(chǎn)生的活性自由基可直接或間接破壞機體細(xì)胞的生物膜和核酸[5]，可致DNA 鏈斷裂，使組織器官形態(tài)、代謝功能、作用機制及組織細(xì)胞內(nèi)酶活性和微循環(huán)等發(fā)生改變，若不及時清除自由基，會使組織發(fā)生更為嚴(yán)重的物理或化學(xué)損傷[6-7]。

圖2 小鼠肝細(xì)胞內(nèi)SOD活性的改變

放射性肝損傷常見于全身放射性損傷（核泄漏、核爆炸等核事故的發(fā)生），以及腹部、盆腔腫瘤局部放射治療時產(chǎn)生的輻射損傷。放射性肝損傷導(dǎo)致細(xì)胞變性、凋亡、壞死，肝酶系紊亂，生物膜破壞，代謝障礙，嚴(yán)重時引起肝功能衰竭。在正常情況下，人體內(nèi)的自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中，而自由基的清除主要依靠抗氧化酶的作用。SOD是一種普遍存在于有機生物體內(nèi)的金屬酶，它具有超強的氧化作用，可催化自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，清除自由基，從而保護受損細(xì)胞，維持機體的氧化和抗氧化反應(yīng)的動態(tài)平衡。MDA是過氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物，對機體細(xì)胞有攻擊力，檢測MDA的含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反應(yīng)細(xì)胞的損傷情況。MDA與SOD測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低又間接反映了機體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度。

圖3 小鼠肝細(xì)胞內(nèi)MDA含量的改變

表1 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的SOD活性（U/mg，，n=5）

表1 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的SOD活性（U/mg，，n=5）

第1 d和第2 d方差不齊，采用Dunnett T3檢驗；第7 d和第14 d方差齊，采用LSD檢驗；輻射組與正常組比較*P＜0.01，普通組與輻射組比較**P＜0.01，加強組與普通組比較***P＜0.05

表2 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的MDA含量（nmol/mg，，n=5）

表2 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的MDA含量（nmol/mg，，n=5）

方差不齊，采用Dunnett T3檢驗；輻射組與正常組比較*P＜0.01,普通組與輻射組比較**P＜0.01，加強組與普通組比較***P＜0.05

間充質(zhì)干細(xì)胞是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，具有自我復(fù)制和多向分化的潛能，并且可以自我更新，在特定條件下分化增殖為多種組織和器官的細(xì)胞。目前，我們能夠從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肺、肝、胰腺等組織，以及羊水、臍帶血中分離和制備間充質(zhì)干細(xì)胞，用得最多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。成人骨髓供體難求，很難獲取，數(shù)量極少，且可對供體造成不可避免的創(chuàng)傷，易感染；胎兒的骨髓干細(xì)胞傳代增殖能力雖強，但因胚胎來源問題備受爭議[8]而受到限制；而臍血干細(xì)胞易于獲取，來源廣泛，生物特性穩(wěn)定，增殖分化能力旺盛，對供體無任何傷害，是理想的種子細(xì)胞。因此，本實驗選取UCMSC進行。

本試驗通過制作石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟的病理形態(tài)，發(fā)現(xiàn)輻射后放射組肝細(xì)胞不同程度水腫、變性，中央靜脈周圍明顯有炎性細(xì)胞浸潤，周圍網(wǎng)狀纖維增多，變窄、堵塞，提示接受全身輻射的小鼠肝臟存在輻射損傷，說明模型制作成功。經(jīng)注射UCMSC懸浮液治療的小鼠肝細(xì)胞水腫減輕，小靜脈周圍網(wǎng)狀纖維減少，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤有所減輕，中央靜脈管壁周圍膠原纖維沉積大幅減少。經(jīng)組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評分表明有顯著性差異。這證實UCMSC 對肝臟組織具有積極的防護抗損傷作用。研究表明，UCMSC 移植進入受試動物肝臟后，有分化為肝細(xì)胞的趨勢[9]，并能間接刺激正常肝細(xì)胞再生，促進損傷肝細(xì)胞的修復(fù)，改善肝細(xì)胞功能[10]。肝細(xì)胞內(nèi)酶的變化顯示，放射組與正常組比較MDA值顯著增高，SOD 值顯著下降，證明了自由基的產(chǎn)生。而經(jīng)注射UCMSC 懸浮液治療后MDA 值顯著下降，SOD值顯著增高（P＜0.01），證明UCMSC能清除自由基，減輕自由基所致的肝細(xì)胞損傷。

UCMSC 對輻射性肝損傷的修復(fù)再生作用的機制非常復(fù)雜：一是某些特殊細(xì)胞因子如SDF-1、TGF-β、MIP-1α、MCP-I 等引導(dǎo)UCMSC 到肝臟損傷的局部組織[11]，在組織局部適宜環(huán)境條件下誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞；二是到達(dá)組織局部的UCMSC在刺激因子[12]的作用下分化為肝細(xì)胞；三是UCMSC可以分泌細(xì)胞因子（IL-6）[13]刺激局部肝損傷組織細(xì)胞的修復(fù)?？偠灾?，UCMSC 移植具有清除自由基、減輕肝損傷和促進損傷肝細(xì)胞修復(fù)再生的作用，能夠有效改善肝臟功能，但注射劑量、時間及次數(shù)可能會影響治療效果。由于間接或直接因素的作用刺激局部損傷組織細(xì)胞的修復(fù)再生，應(yīng)用后的療效評價會直接影響臨床應(yīng)用前景。為使UCMSC 成為臨床理想的治療手段，其具體機制機理還有待進一步探究。

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