分離自嬰兒糞便的嗜酸乳桿菌和長雙歧桿菌的常溫保存探究

黃魁英 ，肖安吉，盧志鵬，楚品品，杜少平，明飛平，夏楓耿，黃朝遠(yuǎn)，楊軍，蔡海明，馬苗鵬，張玲華

1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣州市微生物研究所，廣東 廣州 510663

人體消化道內(nèi)存在的微生物總數(shù)達(dá)1014個[1]，菌體總重量1000～1500 g，占人體總重的1/70～1/50[2]。雙歧桿菌在成人腸道中占腸道總菌數(shù)的3%～10%，在嬰兒腸道占到91%以上[3]。隨著年齡的增長，體內(nèi)有效的有活性的乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量會逐漸下降，為了保持腸道菌數(shù)，需要進(jìn)食能提高相關(guān)益生菌活性的食物，最常見的添加益生菌是乳桿菌和雙歧桿菌2個屬[4-5]。益生菌具有如下特點(diǎn)：活性強(qiáng)，在體內(nèi)不易被殺死；數(shù)量多，只有大量攝入并且大量存活在體內(nèi)才能發(fā)揮功效；對正常的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，使有益菌繁殖從而抑制有害菌的生長；產(chǎn)生其他一些促進(jìn)健康的作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇等[6]。研究表明，維持益生菌功能的最低活菌濃度應(yīng)高于107CFU/mL[7]。

目前我國益生菌產(chǎn)品面臨的關(guān)鍵問題是工業(yè)、胃腸道脅迫對菌株的各種破壞效應(yīng)，如產(chǎn)品的制造、貯存、銷售、食用過程。雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等益生菌多為厭氧菌或兼性厭氧菌，生長過程中不形成芽孢，抗性較差，生命活動中還會產(chǎn)生一些危及自身繁殖的乳酸和乙酸等代謝物，故在液體條件下難以長期保存；另外，益生菌產(chǎn)品的貯存和運(yùn)輸均要求冷鏈，貨架期較短[8]。

為了尋找活性較好的益生菌，并探究在常溫下保持其較高活性的可行方法，我們采用均勻?qū)嶒炘O(shè)計方案，摸索分離自嬰兒糞便的嗜酸乳桿菌和長雙歧桿菌的保護(hù)劑成分最佳比例，為這類益生菌在日常生活中實現(xiàn)簡單的常溫保存、利于實際生產(chǎn)過程中的運(yùn)輸和保存提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

乳酸菌原培養(yǎng)基（500 mL）：蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，醋酸鈉2 g，瓊脂7.5 g，水500 mL。121℃高溫濕熱滅菌22 min。

雙歧桿菌原培養(yǎng)基（500 mL）：蛋白胨5 g，酵母膏10 g，葡萄糖10 g，西紅柿汁166 mL，吐溫80 1 mL，瓊脂7.5 g，水333 mL。121℃高溫濕熱滅菌22 min。

1.2 獲取菌源及乳酸菌和雙歧桿菌的分離

收取嬰兒糞便約0.1 g，置于盛有10 mL無菌水的試管中，充分搖勻后吸取1 mL 稀釋液加至9 mL無菌水中，重復(fù)相同操作便可得到1/10 梯度稀釋的糞便稀釋液。選擇1/103、1/104、1/105梯度的稀釋液，用涂布法培養(yǎng)于乳酸菌篩選培養(yǎng)基中，用滾管法培養(yǎng)于雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，最后鑒別并挑選乳酸菌和雙歧桿菌的單菌落，并編號。

1.3 菌株的純化即優(yōu)良菌種篩選

在無菌條件下，用接種環(huán)挑取鑒定培養(yǎng)基上初步確定的革蘭陽性菌落，在MRS平板培養(yǎng)基上劃線分離，37℃倒置厭氧培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，直至確定所得菌株已經(jīng)純化。然后接種到液體培養(yǎng)基中保存，其中一部分菌液用甘油于4℃保存，作為菌種。

對各菌種進(jìn)行耐溫、耐鹽和產(chǎn)酸檢測，挑出綜合性能較好的菌種。

1.4 探索菌株保存條件

將嗜酸乳桿菌的保護(hù)劑成分[9]和長雙歧桿菌的保護(hù)劑成分[10]按照均勻設(shè)計方法調(diào)配（表1、2）。

1.5 添加菌種保存

用磷酸緩沖液將表1、2中不同濃度的保護(hù)劑配制成不同配方的復(fù)合保護(hù)劑10 mL，分別取500 μL復(fù)合保護(hù)劑加入450 μL 菌液和50 μL 甘油的混合液，預(yù)先放在4℃中保存10 min，待菌液充分低溫，用離心干燥機(jī)干燥，每隔10 min稱重，干燥到2次稱量質(zhì)量差少于0.01 g時即干燥完成。

1.6 37℃加速常溫存放

將干燥后的菌種于37℃恒溫箱中存放，1 d 相當(dāng)于常溫下4 d（加速4倍時間）。

1.7 檢測保存后菌種活性

每10 d取出樣品進(jìn)行活菌數(shù)檢測，對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)處理，調(diào)配出最佳配方。

1.8 重新保存

用最佳配方重復(fù)保存菌種，記錄數(shù)據(jù)，觀察保存效果。

表2 長雙歧桿菌的保護(hù)劑配方（g/L）

2 結(jié)果

2.1 菌種的分離鑒定

分離獲得一株革蘭陽性菌，形態(tài)呈細(xì)長桿狀，最適生長溫度為35～38℃，20℃以下不生長，耐熱性差；最適pH 值為5.5～6.0，耐酸性強(qiáng)，能在其他乳酸菌不能生長的環(huán)境中生長繁殖；能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)行同型發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)生DL型乳酸；蛋白質(zhì)分解力弱。最終確定該菌種為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），命名為10A31。屬乳桿菌科的乳桿菌屬細(xì)菌廣泛存在于人及一些動物的腸道中，是有益微生物菌群，對維持胃腸道的生理功能有重要作用。

分離到的另一株菌為嚴(yán)格厭氧型革蘭陽性菌，細(xì)胞通常為分叉形狀，最適生長溫度為37～41℃，起始生長pH 值為6.7～7.0，pH 值低于4.5 和高于8.5 時不生長；卵磷脂酶反應(yīng)、過氧化氫酶反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、聯(lián)苯胺反應(yīng)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗均呈陰性；不分解鼠李糖、甘油、纖維二糖、甘露醇、淀粉，能分解阿拉伯糖、木糖、核糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、半乳糖，對山梨糖分解遲緩；代謝產(chǎn)物產(chǎn)生乙酸和乳酸，不產(chǎn)生甲酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸。最終確定該菌種為長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum），命名為11A11。

經(jīng)培養(yǎng)，嗜酸乳桿菌10A31 菌落數(shù)能達(dá)到的最大數(shù)量為2.40×1010CFU/mL，長雙歧桿菌11A11菌落數(shù)能達(dá)到的最大數(shù)量為7.20×109CFU/mL。經(jīng)過篩選的菌種除了具有比較高的活性外，還有較高的耐溫、耐鹽、產(chǎn)酸性質(zhì)。

2.2 嗜酸乳桿菌10A31的保存配方優(yōu)化

實際菌落數(shù)按下式計算：

按照上述公式的計算結(jié)果見表3?？梢钥闯?，添加了保護(hù)劑，的確可以增強(qiáng)嗜酸乳桿菌10A31 在常溫下的保存效果。為了避免正交試驗所需大量試驗次數(shù)，我們采用簡單方便的均勻設(shè)計實驗。3 因素8 水平，用均勻設(shè)計實驗需要做8 次平行，而用正交試驗卻需要做84次平行。在前4 次計數(shù)中，干燥后的菌落數(shù)都穩(wěn)定地保持在109CFU/g水平。

用軟件Excel分析表3數(shù)據(jù)，由卡方分析可知麥芽糖對嗜酸乳桿菌10A31 的保存存在不相關(guān)關(guān)系，因此可忽略保護(hù)劑配方中麥芽糖這一因素。由回歸分析可得：

其中，y為每克嗜酸乳桿菌10A31中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)（CFU/g），x1為海藻糖的濃度（g/L），x2為谷氨酸的濃度（g/L），x3為天冬氨酸的濃度（g/L）。

計算得出嗜酸乳桿菌10A31保護(hù)劑最佳配方及濃度為：海藻糖0.05 g/L，谷氨酸0.24 g/L，天冬氨酸0.24 g/L。即，保護(hù)劑最佳配方比例為海藻糖∶谷氨酸∶天冬氨酸=5∶24∶24。

2.3 長雙歧桿菌11A11的保存配方優(yōu)化

同樣根據(jù)上述公式計算，結(jié)果見表4。干燥后的菌落數(shù)在第3 次計數(shù)時僅為108CFU/g，且活性不穩(wěn)定。在第40 d計數(shù)時，活菌數(shù)達(dá)不到106CFU/g。

用軟件Excel分析表4，由回歸分析可得：

其中，y為每克長雙歧桿菌11A11中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)（CFU/g），x1為海藻糖的濃度（g/L），x2為谷氨酸的濃度（g/L），x3為麥芽糖的濃度（g/L）。

同樣按照嗜酸乳桿菌數(shù)據(jù)處理方法，得出長雙歧桿菌11A11 的保護(hù)劑最佳配方及濃度為：海藻糖0.34 g/L，谷氨酸0.11 g/L，麥芽糖0.24 g/L。即，保護(hù)劑最佳配方比例為海藻糖∶谷氨酸∶麥芽糖=34∶11∶10。

2.4 最佳配方保存試驗

采用嗜酸乳桿菌10A31 保護(hù)劑最佳配方（海藻糖0.05 g/L，谷氨酸0.24 g/L，天冬氨酸0.24 g/L）重新用于菌株保存，在第5 次實驗（相當(dāng)于常溫下的200 d）時，最終菌落數(shù)為3.87×109CFU/g。

采用長雙歧桿菌11A11 保護(hù)劑最佳配方（海藻糖0.34 g/L，谷氨酸0.11 g/L，麥芽糖0.24 g/L）重新用于菌株保存，第4次實驗（相當(dāng)于常溫下的160 d）時菌落數(shù)為1.53×109CFU/g，而第5 次實驗時為6.80×107CFU/g。與之前實驗數(shù)據(jù)比較，可以看出優(yōu)化后最佳配方的活菌數(shù)明顯比優(yōu)化前有所提高。

表3 嗜酸乳桿菌10A31的菌落數(shù)（CFU/g）

表4 長雙歧桿菌11A11的菌落數(shù)（CFU/g）

由圖1 可知，嗜酸乳桿菌10A31 在最佳配方保護(hù)劑條件下，200 d時仍然可以保持較高的菌活性，菌落數(shù)水平在109CFU/g 以上；長雙歧桿菌11A11在160 d時菌落數(shù)水平可達(dá)109CFU/g，但在200 d時菌落數(shù)急劇下降。2種益生菌的菌落數(shù)都隨著時間的延長而逐漸減少，菌活性也隨之降低。嗜酸乳桿菌由于厭氧要求比長雙歧桿菌低，因此保存難度相對簡單。在最佳保護(hù)劑保存下，這2 類益生菌能在160～200 d內(nèi)保持較高的活菌水平。

圖1 益生菌采用最佳保護(hù)劑配方的常溫保存菌落計數(shù)

3 討論

從實驗結(jié)果可以看出，2 種保護(hù)劑成分都是具有一定黏性的物質(zhì)，能在菌表面形成一定的覆蓋膜，使菌體遠(yuǎn)離空氣中氧氣的毒害作用。其中，海藻糖的比例都比較高，可見海藻糖對于菌種保存具有不可忽視的作用。

本實驗所得保護(hù)劑能把益生菌在較長時間（嗜酸乳桿菌200 d，長雙歧桿菌160 d）內(nèi)保護(hù)在109CFU/g 水平。通過均勻設(shè)計實驗方法探究保護(hù)劑的成分最佳配方，相比于正交試驗，大大縮減了實驗次數(shù)和復(fù)雜程度，且簡單有效。后續(xù)擬針對不通過37℃加速培養(yǎng)，延長菌株活性檢測時間，擴(kuò)大保護(hù)劑的成分進(jìn)行探索，以完善常溫保存益生菌的最佳保護(hù)劑配方。

[1]Guarner F,Malagelada J R.Gut flora in health and disease[J].Lancet,2003,361:512-519.

[2]梁金鐘.益生菌研究進(jìn)展及在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑,2007,G00:429-435.

[3]Kiviharju K,Leisola M,Eerikainen T.Optimization of a Bifidobacterium longum production process[J].J Biotechnol,2005,117:299-308.

[4]周蕊,白瑤.食品工業(yè)用益生菌安全性評價研究進(jìn)展[J].衛(wèi)生研究,2012,41(3):511-514.

[5]尹勝利,杜鑒,徐晨.乳酸菌的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用[J].食品科技,2012,37(9):25-29.

[6]任大勇.益生乳酸桿菌的黏附及免疫調(diào)節(jié)作用研究[D].長春:吉林大學(xué),2013.

[7]Homayouni A,Azizi A,Ehsani M R,et al.Effect of microencapsulation and resistant starch on the probiotic survival and sensory properties of synbiotic ice cream[J].Food Chem,2008,111:50-55.

[8]田芬.抗胃腸道脅迫益生菌的篩選及產(chǎn)品開發(fā)[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[9]雷欣宇.乳酸菌活性干燥劑制備工藝的研究[D].重慶:西南大學(xué),2013.

[10]胡曼.兩歧雙歧桿菌培養(yǎng)及凍干保護(hù)劑的研究[D].西安:陜西科技大學(xué),2012.