核輸入蛋白α/β真核表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞內(nèi)定位

羅曉麗 ，周蕾，丁麗華，張亞楠，劉婕，賈曉蒙，陳瀅潔，熊加秀，陳志達(dá)，葉棋濃，趙麗純

1.吉林大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長春 130021；2.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100038；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

細(xì)胞外信號主要通過相應(yīng)受體及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而引起細(xì)胞發(fā)生核反應(yīng)，在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡及與細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)的物質(zhì)合成調(diào)控中起重要作用。進(jìn)入胞質(zhì)的信號分子及其活化產(chǎn)物必須通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核，才可以引起核反應(yīng)。真核細(xì)胞核膜上分布的核孔復(fù)合體（nuclear pore complex，NPC）是細(xì)胞核內(nèi)外進(jìn)行物質(zhì)交換的主要通道，分子較小的化合物可自由通過NPC或采取被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞核，而相對分子質(zhì)量在50 000以上的蛋白則通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核[1]，而核輸入蛋白（importin）能幫助具有核定位信號（nuclear localization signal，NLS）的蛋白質(zhì)入核，在蛋白質(zhì)的入核過程中發(fā)揮十分重要的作用。核輸入蛋白有α和β兩種亞基，存在于胞質(zhì)中，入核蛋白通過NLS識別細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核輸入蛋白α，并與之結(jié)合形成“核輸入蛋白-底物”二聚體，再與核輸入蛋白β形成復(fù)合物，幫助入核蛋白通過NPC 進(jìn)入核內(nèi)，在核內(nèi)RanGTP 酶的作用下，復(fù)合物發(fā)生解聚，入核蛋白被釋放在核內(nèi)[2]，而核輸入蛋白與RanGTP 形成新的復(fù)合物通過NPC重返細(xì)胞質(zhì)，在胞質(zhì)內(nèi)RanGTP 水解為RanGDP，同時(shí)核輸入蛋白被釋放參與新一輪的入核轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。

我們擬構(gòu)建核輸入蛋白α/β的真核表達(dá)載體，并通過免疫熒光染色技術(shù)確定其細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究其生物活性及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T 細(xì)胞、pXJ-40-myc 載體來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR 試劑購自TaKaRa 公司；VigoFect 購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；DMEM及小牛血清購自Gibco公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；測序由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 myc-Importin α/β重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

以乳腺癌文庫為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的核輸入蛋白α/β的編碼序列[4-5]合成引物。核輸入蛋白α上游引物為5'-CGGGATCCATGTCCACCAACGAGAA TGC-3'，下游引物為5'-ATAAGAATGCGGCCGCCT AAAAGTTAAAGGTCCCAGG-3'；核輸入蛋白β上游引物為5'-CGGGATCCATGGAGCTGATCACCATTC TCG-3'，下游引物為5'-ATAAGAATGCGGCCGCTC AAGCTTGGTTCTTCAGTTTC-3'。按以下條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃7 min再延長。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切pXJ-40-myc 載體，經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ/NotⅠ酶切，形成帶有與載體相同黏性末端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40-myc 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆送北京奧科生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測

按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用含雙抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將293T細(xì)胞接種于6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到80%為宜，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 換液。將4 μL Vigo-Fect 與200 μL NaCl 混合，再將總量為10 μg 的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl 混合，然后將上述2 種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空pXJ-40-myc 載體作為對照，37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h換液。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞蛋白，加入2×SDS 加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進(jìn)行SDSPAGE 后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP 標(biāo)記的抗myc 標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 免疫熒光檢測

將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的24孔板從培養(yǎng)箱中取出，1×PBS 洗3 次；用40 g/L 多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，每次10 min；加入含0.5% Triton X-100和1%羊血清的PBS 冰上滲透10 min；用含1%羊血清的PBS 封閉30 min，滴加Alexa Fluor 594 標(biāo)記的抗myc-tag 抗體（1∶2000），室溫孵育1 h；1×PBS 洗3次，每次10 min；用0.1 g/mL DAPI染核，1×PBS洗2次，每次5 min；封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 myc-Importin α/β重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室保存的乳腺癌文庫為模板，PCR 擴(kuò)增核輸入蛋白α/β的編碼序列，分別獲得約1590 和2630 bp 的DNA 片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切后，再與經(jīng)相同酶切的pXJ-40-myc 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆進(jìn)行菌液PCR 鑒定，初步篩選帶有核輸入蛋白α/β基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定均可切出2 條長度分別約為5000和1590 bp 及5000 和2630 bp 的條帶，符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。DNA序列測定結(jié)果表明插入片段的DNA序列與核輸入蛋白α/β基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

2.2 Western 印跡檢測myc-Importin α/β在293T 細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 PCR擴(kuò)增核輸入蛋白α/β的編碼序列

將構(gòu)建的myc-Importin α/β重組質(zhì)粒和myc 空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞系，24 h 后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western 印跡檢測蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用myc-HRP 抗體能夠在相對分子質(zhì)量約62×103和100×103大小處分別檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶（圖3），說明重組蛋白在293T細(xì)胞中能夠正確表達(dá)。

2.3 熒光顯微鏡觀察myc-Importin α/β在293T 細(xì)胞中的定位

為了了解核輸入蛋白α/β在細(xì)胞中的定位，將構(gòu)建的myc-Importin α/β重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染myc-Importin α重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，紅色熒光在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有分布；而轉(zhuǎn)染myc-Importin β重組質(zhì)粒的293T 細(xì)胞中，紅色熒光主要集中于細(xì)胞核。說明myc-核輸入蛋白α融合蛋白表達(dá)后在293T 細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有分布，而myc-核輸入蛋白β融合蛋白主要定位于細(xì)胞核（圖4）。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，核輸入蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中，運(yùn)送蛋白進(jìn)入細(xì)胞核[6]，而在本實(shí)驗(yàn)中通過免疫熒光檢測到核輸入蛋白α存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，而核輸入蛋白β主要存在于細(xì)胞核。我們認(rèn)為細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)所描述的是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，而免疫熒光技術(shù)是把蛋白固定在了一個(gè)時(shí)間點(diǎn)再進(jìn)行檢測，另外可能由于實(shí)驗(yàn)方法的不同，所以出現(xiàn)了其主要定位于核中的情況。

圖2 重組質(zhì)粒myc-Importin α/β的BamHⅠ/NotⅠ雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜

3 討論

核輸入蛋白α通過識別和結(jié)合靶蛋白的NLS 幫助蛋白質(zhì)入核，是核孔靶向復(fù)合物的重要組成部分。其主要分為3 個(gè)結(jié)構(gòu)單元：未知功能的親水羧基端、帶正電既能結(jié)合自身序列中的串聯(lián)重復(fù)模體又能結(jié)合核輸入蛋白β的結(jié)構(gòu)域（importin β binding doman，IBB），以及一個(gè)大的NLS 中央結(jié)合結(jié)構(gòu)域[7]。核輸入蛋白α在進(jìn)化過程中結(jié)構(gòu)和功能上比較保守，如人的6 個(gè)輸入蛋白呈現(xiàn)60%的序列相似性[8-9]；而核輸入蛋白β家族成員在功能上保守，在蛋白質(zhì)序列上呈現(xiàn)較低的相似性[10]。核輸入蛋白β家庭成員相對分子質(zhì)量為95×103～145×103，結(jié)構(gòu)上都具有保守的N端Ran結(jié)合結(jié)構(gòu)域（IBN-N domain）和多個(gè)HEAT Repeats結(jié)構(gòu)域[11]。HEAT是由連續(xù)重復(fù)的37～46 個(gè)氨基酸殘基組成的螺旋形棒狀結(jié)構(gòu)單元，而HEAT Repeats是由多個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域疊加形成的具有延展性的超螺旋，可以通過改變構(gòu)象以配合結(jié)構(gòu)不同的底物。另外，核輸入蛋白β可以使用4種接頭蛋白來識別不同類型的底物，從而使得一個(gè)受體可以擁有廣泛的底物類型，協(xié)調(diào)了少數(shù)受體與大量底物之間的矛盾[12-13]。大多數(shù)核輸入蛋白β家族成員可以直接識別底物的NLS 并與之結(jié)合，而核輸入蛋白β1 卻需要通過與核輸入蛋白α的N 端IBB結(jié)構(gòu)域結(jié)合[14]，借助其作為接頭蛋白，從而識別具有經(jīng)典核定位信號的底物。

圖3 Western印跡檢測重組核輸入蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)

圖4 myc-Importin α/β在293T細(xì)胞中的定位（熒光顯微鏡，×400）

核輸入蛋白家族成員介導(dǎo)真核細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，是核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要樞紐，也是外來蛋白質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞的有效途徑，如一些病毒是通過與核輸入蛋白α的結(jié)合從而完成入核[15]。Smad-3 具有保守的NLS序列，與Smad-4 結(jié)合形成Smad-3/Smad-4 復(fù)合物，輸入蛋白可識別其NLS 序列從而運(yùn)送其入核，通過Smad-3/Smad-4 的MH1 發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)與DNA 上的Smads結(jié)合元件（smads-binding element，SBE）結(jié)合，在其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用下調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。MDM2 可以與p53 的轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制p53 的轉(zhuǎn)錄活性[17-18]；MDM2 也可以通過其自身的NES和NLS序列從胞核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，并將p53蛋白移位至胞質(zhì)中，然后在胞質(zhì)蛋白酶的作用下p53 蛋白被降解，從而使細(xì)胞發(fā)生抗凋亡而癌變[19]。

蛋白質(zhì)入核是十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到蛋白質(zhì)磷酸化水平、核轉(zhuǎn)運(yùn)因子等諸多因素在多個(gè)水平上的多重調(diào)控，從而使得功能蛋白及其他核蛋白精確分布并正常發(fā)揮功能。若蛋白質(zhì)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受到干擾，將影響其功能的發(fā)揮，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。探明蛋白質(zhì)的入核機(jī)制和調(diào)節(jié)機(jī)制，對研究機(jī)體的生命活動(dòng)，闡明疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)理，以及對新藥物的研發(fā)都具有重要意義。

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