雌激素受體α磷酸化位點(diǎn)突變體T224A和S559A的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)

陳偉 ，周鵬宇，朱永杰，馬勝利，曹葉,4，張萍萍,5，何湘，魏從文，鐘輝，吳飛翔

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧 530021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；3.安徽大學(xué) 健康科學(xué)院，安徽 合肥 230039；4.吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012；5.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 250031

乳腺癌是現(xiàn)代女性最常見的腫瘤之一，它的發(fā)生發(fā)展和許多因素相關(guān)，其中與雌激素受體（estrogen receptor，ER）的關(guān)系最為密切[1-2]。ER屬于類固醇核受體，包括ERα和ERβ兩個(gè)亞型，ERα促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，而ERβ抑制乳腺癌的發(fā)生[3-4]。目前關(guān)于ERα的研究相對(duì)較多。ERα含595個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為66×103，包含5 個(gè)結(jié)構(gòu)域，依次為不依賴配體激活的AF1、負(fù)責(zé)與靶基因啟動(dòng)子的雌激素反應(yīng)元件（estrogen receptor elements，ERE）特異結(jié)合的DNA 結(jié)合域（DNA binding domain，DBD）、核定位信號(hào)的鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合功能區(qū)（ligand-binding domain，LBD）和配體依賴轉(zhuǎn)錄的AF2，以及功能不詳?shù)目勺儏^(qū)[5-7]。ERα常發(fā)生翻譯后修飾，如磷酸化、泛素化、甲基化、乙?；UMO、棕櫚化，其中以磷酸化最為常見?，F(xiàn)已報(bào)道的ERα磷酸化位點(diǎn)有十幾個(gè)，其中研究比較透徹的有7個(gè)，為S104、S106、S118、S167、S236、S305 及Y537[8-9]。不同區(qū)域磷酸化對(duì)ERα的作用也不同，如DBD區(qū)的S236 位點(diǎn)在蛋白激酶A 作用下發(fā)生磷酸化，從而抑制ERα二聚化形成，阻斷其與DNA 的結(jié)合；而由Src酪氨酸激酶介導(dǎo)的Y537 磷酸化主要調(diào)節(jié)ERα與E2的結(jié)合能力[10-11]。這些翻譯后修飾常常調(diào)節(jié)ERα與ERE的結(jié)合，從而激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，包括c-myc、BCL-2、Bcl-XL、Cyclin D1、IL-8，這些下游基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[12-13]。因此，ERα翻譯后修飾常為乳腺癌研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

本課題組前期在乳腺癌相關(guān)研究中，通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)在ERα DBD 區(qū)224 位蘇氨酸（T224）和可變區(qū)559 位絲氨酸（S559）發(fā)生磷酸化。雖然559 位絲氨酸發(fā)生磷酸化已有報(bào)道，但對(duì)其研究尚少[9]，而224 位蘇氨酸磷酸化尚無報(bào)道。為此，我們構(gòu)建了ERα 224 位蘇氨酸、559 位絲氨酸磷酸化突變點(diǎn)載體，通過螢光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)這些突變位點(diǎn)對(duì)ERα活性是否產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T 細(xì)胞、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、pRL 質(zhì)粒、ERE 啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（EREluc）及pcDNA3-Flag 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-Flag-ERα為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；引物合成及測(cè)序由奧科鼎盛生物技術(shù)公司完成；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；高保真PfuDNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Tiangen 公司；螢光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自Promega公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco生物公司；胎牛血清購(gòu)自杭州江濱公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司；鼠抗Flag 抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；雌激素、HRP標(biāo)記的鼠抗微管蛋白抗體購(gòu)自Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 擴(kuò)增突變片段

利用重組PCR擴(kuò)增ERα（T224A）、ERα（S559A）突變片段，即ACC突變?yōu)镚CC、TCC突變?yōu)镚CC。根據(jù)ERα基因序列及點(diǎn)突變需要設(shè)計(jì)引物（表1），由奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成。

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的野生型ERα質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)的引物，通過PCR 擴(kuò)增出含有點(diǎn)突變的上、下游目的基因片段（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；68℃延伸7 min），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及上、下游片段回收，以等摩爾比例的上、下游配對(duì)片段為共同模板，利用搭橋法進(jìn)行二次PCR（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸120 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；68℃延伸7 min），擴(kuò)增出點(diǎn)突變的全長(zhǎng)目的基因片段。

1.3 構(gòu)建磷酸化位點(diǎn)突變載體

把全長(zhǎng)點(diǎn)突變片段、pcDNA3-Flag 質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/EcoRⅠ于37℃雙酶切過夜，利用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段和質(zhì)粒，再以6∶1（片段∶質(zhì)粒）的比例混合，室溫連接10 min后把連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在氨芐西林培養(yǎng)板上于37℃培養(yǎng)過夜，篩選陽(yáng)性克隆，以陽(yáng)性克隆為模板再次行PCR，確定重組質(zhì)粒上含有目的基因片段后，送奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清、200 U/mL 青霉素、200 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至10 mm培養(yǎng)皿的60%～80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 更換4 mL 新鮮培養(yǎng)基。先把4 μg 構(gòu)建的質(zhì)粒、4 μL 轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000 分別加入200 μL 生理鹽水中混合，靜置5 min，把混有轉(zhuǎn)染試劑的生理鹽水加入混有質(zhì)粒的生理鹽水中，靜置15 min，均勻地加入培養(yǎng)基中，4 h后補(bǔ)4～6 mL新鮮培養(yǎng)基。

1.5 免疫印跡分析

轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，加入SDS 上樣緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，0.1%溴酚藍(lán)，2%SDS，10%甘油，2.5% β-巰基乙醇），沸水浴10 min，離心10 min 后取上清進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 或4℃過夜，然后加入稀釋的Flag 抗體，室溫孵育1 h或4℃孵育過夜；用1×TBST洗膜3次，每次5 min，再加入稀釋的帶有辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，再次用1×TBST洗膜3次，每次5 min，然后將含有辣根過氧化物酶底物的ECL 滴加至膜上，隨即在暗室中壓片顯影。

表1 引物及序列

1.6 螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

把HEK293T 細(xì)胞接種到6 孔板培養(yǎng)，用無指示劑的白色DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，等長(zhǎng)至60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組設(shè)立分別為：①pcDNA3-Flag（1 μg/孔）；②pcDNA3-Flag-ERα質(zhì)粒（1 μg/孔）；③pcDNA3-Flag-ERα（T224A）突變質(zhì)粒（1 μg/孔）；④pcDNA3-Flag-ERα（S559A）突變質(zhì)粒（1 μg/孔）。以上組均與ERE-luc 質(zhì)粒（0.8 μg/孔）、pRL 質(zhì)粒（0.008 μg/孔）共轉(zhuǎn)，培養(yǎng)基中加入或不加入雌激素（10 nmol/L），共8組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。先用1×PBS洗滌細(xì)胞2 次，再向各孔中加入100 μL 細(xì)胞裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，把細(xì)胞裂解物收集到1.5 mL離心管中，4℃、12 000 r/min 離心5 min，取30 μL 上清用于螢光素酶活性測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著性概率水平定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 ERα T224A、S559A突變基因片段的擴(kuò)增

以pcDNA3-Flag-ERα質(zhì)粒為模板，通過重組PCR 擴(kuò)增點(diǎn)突變的上、下游片段。經(jīng)電泳鑒定（圖1），T224A上、下游片段為600～1000 bp，S559A上游約1700 bp，下游約100 bp；再以配對(duì)上、下游片段為共同模板，二次PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)的突變基因片段，均約1800 bp。

2.2 ERα T224A、S559A突變質(zhì)粒構(gòu)建

將T224A、S559A 突變體擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3-Flag質(zhì)粒均用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，回收，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，用氨芐西林培養(yǎng)板培養(yǎng)。以陽(yáng)性克隆菌液為模板，重復(fù)PCR 檢測(cè)質(zhì)粒中是否含有目的基因片段。電泳結(jié)果如圖2，PCR 產(chǎn)物約1800 bp，證明質(zhì)粒上含有目的基因片段。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明插入片段為ERα突變體片段（序列略）。

2.3 Western印跡檢測(cè)ERα突變體的表達(dá)

圖1 瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增ERα突變體產(chǎn)物

分別將pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）及對(duì)空載體對(duì)照pcDNA3-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用抗Flag 抗體檢測(cè)pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的表達(dá)，Western 印跡結(jié)果如圖3。與空載體對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的細(xì)胞，均顯示有一條相對(duì)分子質(zhì)量約66×103的特異性條帶，與預(yù)期大小吻合，說明pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）在HEK293T細(xì)胞中均獲得良好表達(dá)。

2.4 螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)突變體活性

圖2 突變體表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定

圖3 ERα及突變體的Western印跡檢測(cè)

圖4 ERα及其突變體在有或無E2時(shí)的轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)

將pcDNA3-Flag、pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）分別與ERE-luc 和pRL 共轉(zhuǎn)入HEK293T 細(xì)胞，用無指示劑的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，行螢光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果如圖4。無雌激素時(shí)，pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的活性分別是pcDNA3-Flag 的1.94、1.49 和1.84 倍（P＜0.05）；與pcDNA3-Flag-ERα（T224A）相比，pcDNA3-Flag-ERα和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的活性明顯減低（P＜0.05），pcDNA3-Flag-ERα（S559A）與pcDNA3-Flag-ERα的活性差異不顯著（P＜0.05）。有雌激素時(shí)，pcDNA3-Flag 活性增加了0.54 倍，pcDNA3-Flag-ERα活性增強(qiáng)了1.57 倍，而pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）活性分別增強(qiáng)了0.54 和0.61 倍，說明在雌激素作用下，pcDNA3-Flag-ERα活性增強(qiáng)明顯高于pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）（P＜0.05）。因此，在HEK293T 細(xì)胞中，224 位蘇氨酸的磷酸化修飾對(duì)ERα活性起著重要的作用，同時(shí)2 個(gè)磷酸化位點(diǎn)對(duì)雌激素調(diào)節(jié)ERα的活性也發(fā)揮重要作用。

3 討論

ERα與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療效果密切相關(guān)，因此乳腺癌的內(nèi)分泌治療主要以ERα介導(dǎo)的通路為靶點(diǎn)，如氟維司群（fulvestrant）抑制ERα的表達(dá)；他莫昔芬（tamoxifen）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ERα，減少雌激素與ERα結(jié)合[14-15]。但在臨床上內(nèi)分泌治療常常出現(xiàn)耐藥性，這些耐藥性常與翻譯后修飾有關(guān)，其中以磷酸化最為常見[2]，因此，研究ERα的磷酸化對(duì)探討耐藥機(jī)制及藥物開發(fā)都有重要意義[16-17]。

有關(guān)ERα磷酸化的研究很多，已報(bào)道有十幾個(gè)磷酸化位點(diǎn)分布在各個(gè)區(qū)域，其中研究較透徹的位點(diǎn)有7 個(gè)，包括AF1 區(qū)的S104、S106、S118、S167，DBD 區(qū)的S236，LBD 區(qū)的S305 及AF2 區(qū)的Y537。前期我們通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，ERα在DBD 區(qū)的224位蘇氨酸和可變區(qū)的559 位絲氨酸發(fā)生磷酸化，而目前關(guān)于559位絲氨磷酸化的研究甚少，而224位蘇氨酸磷酸化的研究尚無報(bào)道。我們通過構(gòu)建ERα 224 位蘇氨酸、559 位絲氨磷酸化位點(diǎn)突變體，利用螢光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)法檢測(cè)其活性的改變，發(fā)現(xiàn)224位蘇氨酸突變體活性減弱，而559位絲氨突變體對(duì)雌激素調(diào)控減弱。這可能與224位蘇氨酸處于DBD 區(qū)有關(guān)，該區(qū)主要負(fù)責(zé)與靶基因啟動(dòng)子的ERE 結(jié)合，發(fā)生突變后可能與ERE 的結(jié)合能力減弱，從而使ERα活性減弱[18]?？勺儏^(qū)功能研究尚未清楚，因結(jié)構(gòu)上與AF2區(qū)相鄰，可能與AF2區(qū)有相似的依賴配體調(diào)節(jié)ERα活性功能。因此，可變區(qū)的559 位絲氨突變后，ERα也發(fā)生受雌激素調(diào)控減弱，但需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證?？傊珽Rα磷酸化位點(diǎn)突變體的構(gòu)建及其活性的檢測(cè)，對(duì)ERα的研究有重要意義，對(duì)乳腺癌的研究也可提供一定的幫助。

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