一株產(chǎn)蛋白酶粘質(zhì)沙雷氏菌的分子鑒定與發(fā)酵條件優(yōu)化

張 利，盧利平，，丁功濤，楊舜銓，蔡新東，丁海娥

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心中國(guó)-馬來西亞聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730030）

蛋白酶是一類催化蛋白質(zhì)水解的酶類[1]，其作用是將肽鏈間的肽鍵水解，從而達(dá)到降解蛋白質(zhì)的目的。根據(jù)蛋白酶降解蛋白質(zhì)這一特性，使得蛋白酶制品在飼料、食品、藥品、洗滌劑、皮革、化妝品等領(lǐng)域有較廣泛應(yīng)用，蛋白酶占工業(yè)酶市場(chǎng)將近60%[2-3]。在飼料方面，蛋白酶能夠降解飼料的抗?fàn)I養(yǎng)分子，維持腸道的微生態(tài)平衡，提高蛋白質(zhì)消化利用率，提高動(dòng)物腸道的消化能力[4-5]，促進(jìn)腸道健康[6]。于書坤[7]研究發(fā)現(xiàn)，偏堿性蛋白酶不僅能提高飼料中蛋白質(zhì)的利用率，也能提高飼料中淀粉、脂肪、纖維等結(jié)構(gòu)碳水化合物的利用率，同時(shí)偏堿性蛋白酶能與內(nèi)源蛋白酶和其他飼料酶發(fā)生互補(bǔ)作用促進(jìn)動(dòng)物腸道的吸收。在食品方面，木瓜蛋白酶可作為肉類潤(rùn)滑劑、啤酒品質(zhì)改良劑、餅干松化劑、調(diào)味品、保健品等[8]。在藥品方面，蛋白酶具有抗腫瘤和抗血栓、促進(jìn)傷口愈合、外科消毒劑等作用[9]。由此可見，篩選產(chǎn)蛋白酶的菌株具有重要的意義。

近年來，在產(chǎn)蛋白酶菌株及其發(fā)酵條件等方面做出了很多方面的研究。王永紅等人[10]利用牛奶、豆?jié){作為選擇性培養(yǎng)基，從土壤、水體等自然環(huán)境及家禽內(nèi)臟中篩選出2 株具有高效水解菜粕蛋白產(chǎn)氨基酸的短小芽胞桿菌。劉靜等人[11]從垃圾場(chǎng)淤泥、食堂排污水溝含蛋白量較高的土壤中篩選分離得到的菌株發(fā)酵產(chǎn)生的酶活為2.03 U/mL。陳蘢等人[12]從南昌大學(xué)食堂污水中篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶解淀粉芽孢桿菌。目前，關(guān)于粘質(zhì)沙雷氏菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的研究報(bào)道很少，大多數(shù)對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌的研究都在其他方面。李鑫等人[13]利用天然存在的粘質(zhì)沙雷氏菌Hal 為研究害蟲防治的試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)顆粒劑噴灌法能有效防除雜草。駱縱縱等人[14]從土壤中篩選出一株對(duì)重金屬具有耐性的粘質(zhì)沙雷氏菌，采用控制變量法對(duì)該菌去除鎘進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cd 質(zhì)量濃度為3 mg/L，加菌量為4%，pH 值為9.4，菌齡為 4.5 h及處理時(shí)間為96 h 時(shí)，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除效果最高可達(dá)到91.00%。王俊峰[15]在研究沙雷氏菌降解氟苯蟲酰胺過程中，發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)氟苯蟲酰胺具有最高降解能力，48 h 降解率達(dá)到 52.6%。張平等人[16]在研究粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)榛實(shí)象甲中腸細(xì)菌多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌能夠改變榛實(shí)象甲成蟲中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)酶方面的研究報(bào)道較少，梅建鳳等人[17]從家蠶蛹的腸道中分離出一株產(chǎn)舍肽酶的粘質(zhì)沙雷氏菌LL-413 菌株，發(fā)酵產(chǎn)酶活力達(dá)到1 126 U/mL。耿芳等人[18]從海南土壤中篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶的粘質(zhì)沙雷氏菌，蛋白酶活力可達(dá)到126 U/mL，經(jīng)過優(yōu)化發(fā)酵酶活力可達(dá)到1 932.3 U/mL。

為篩選出一株產(chǎn)蛋白酶的菌株，試驗(yàn)以甘肅省蘭州市榆中縣崖灣奶牛場(chǎng)的牛糞便為篩選樣品，采用酪素培養(yǎng)基篩選出一株產(chǎn)蛋白酶菌株2021-9，通過革蘭氏染色、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA 序列測(cè)定予以鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)條件和發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為該菌株產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)酶條件研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

糞便樣品來自榆中縣崖灣奶牛場(chǎng)，糞便樣品中篩選得到一株產(chǎn)酶量較高的粘質(zhì)沙雷氏菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

①牛肉湯培養(yǎng)基：0.5%牛肉膏，1%可溶性淀粉，0.5%NaCI，pH 值 7.2~7.4，121 ℃下滅菌 20 min。②酪素培養(yǎng)基：0.4%干酪素，0.107%Na2HPO4·7H2O，0.036%KH2PO4，1.8%瓊脂，121 ℃下滅菌 20 min。③基礎(chǔ)培養(yǎng)基：0.3%葡萄糖，2%胰蛋白胨，0.5%NaCl。④基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：5%豆粕，4%蔗糖，3.2%麩皮，0.03%KH2PO4，0.4%Na2HPO4·12H2O，121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 試劑

生化試劑盒，杭州微生物試劑有限公司提供；牛肉膏、可溶性淀粉、NaCI、干酪素、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、瓊脂、L - 酪氨酸、蔗糖、玉米粉、葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉，索萊寶生物科技有限公司提供；豆粕、麩皮、黃豆粉，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司提供。

1.1.4 儀器及設(shè)備

YXQ-LS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；DHG-9146A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；AR224CN 型電子天平，奧豪斯儀器常州有限公司產(chǎn)品；Pico17 型高速離心機(jī)，熱電發(fā)光二級(jí)管有限公司產(chǎn)品；GENESYS 10S 型紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品；L9 型可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1CU 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SG2-FK 型便攜式pH 計(jì)；HH-S4A 型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離純化

稱取2.5 g 牛糞樣品，進(jìn)行剪碎處理后接種至100 mL 牛肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min 條件下富集培養(yǎng)24 h。用生理鹽水梯度稀釋至1×10-4，1×10-5，1×10-6，在酪素培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，將涂布好的平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，篩選出具有透明水解圈的菌落，記錄菌落的形態(tài)、顏色、大小及水解圈大小等。將出現(xiàn)水解圈的菌落在酪素培養(yǎng)基上進(jìn)行3~4 次平板劃線，確定為單一菌落后于25%的甘油，-80 ℃下保存。將篩選的菌株于酪素培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)量透明圈直徑（H） 和菌落直徑（C），比較各個(gè)菌株H/C 值大小，將H/C值較大的、形態(tài)顏色較特殊的菌株作為目標(biāo)菌株。

1.2.2 菌種鑒定

選擇上述步驟純化后水解圈大的、形態(tài)顏色較特殊的編號(hào)為2021-9 的菌株作為目標(biāo)菌株。根據(jù)目標(biāo)菌株的形態(tài)觀察、生理生化特征、16S rDNA 序列測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。將初篩得到的菌株在酪素培養(yǎng)基上劃線得到單一菌落，記錄菌落的大小、顏色、形狀、質(zhì)地等。挑取單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。根據(jù)生理生化試劑盒說明書將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液分別接入生化試劑管，37 ℃下培養(yǎng)24 h，記錄菌株的生理生化特征。將菌液委托北京六合華大基因科技股份有限公司利用通用測(cè)序引物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 對(duì) 菌 株進(jìn)行16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)定。將序列結(jié)果在NCBI-BLAST 中進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，確定該菌株種類。

1.2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線繪制

將已處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液接種至新的牛肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min 條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每隔2 h 進(jìn)行吸光度測(cè)定，利用Origin 9.0 軟件進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制。

1.2.4 菌株生長(zhǎng)條件的研究

將保存在-80 ℃的菌株迅速解凍，接種在牛肉湯培養(yǎng)基中，于轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37 ℃的條件下培養(yǎng) 24 h，每隔2 h 測(cè)定A600，用吸光度值表示菌株生長(zhǎng)情況。

（1） 不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。在2%胰蛋白胨，0.5%NaCl 中分別加入0.3%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉作為碳源，接種量0.1%，以不加菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h 后測(cè)定A600。

（2） 不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。在0.3%蔗糖，0.5%NaCl 中分別加入2%的胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、干酪素作為氮源，接種量0.1%，以不加菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h 后測(cè)定A600。

（3） 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。選擇0.3%蔗糖、2%酵母粉分別作為碳源、氮源，接種量0.1%，以不加菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于溫度33，35，37，39，41 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min 的條件下培養(yǎng)12 h后測(cè)定A600。

（4） 不同pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。選擇0.3%蔗糖、2%酵母粉分別作為碳源、氮源，以培養(yǎng)基自然pH 值為基礎(chǔ)，調(diào)節(jié)pH 值分別為4.7，5.7，6.7，7.7，8.7，接種量0.1%，以不加菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于溫度39 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min 的條件下培養(yǎng) 12 h 后測(cè)定 A600。

1.2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)48 h，利用福林酚法測(cè)定其酶活。試驗(yàn)根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)蛋白酶活的影響，設(shè)定6 組培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成及編號(hào)。

不同培養(yǎng)基編號(hào)及其成分見表1。

表1 不同培養(yǎng)基編號(hào)及其成分

1.2.6 不同發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力測(cè)定

（1） 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參照國(guó)標(biāo)GB/T-23527-2009 蛋白酶制劑[19]繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理，利用Origin 9.0 繪圖。

（2） 酶活測(cè)定。將發(fā)酵液置于4 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min 獲得粗酶液，利用福林酚法進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定結(jié)果使用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 22.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，Origin 9.0作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值X±SD 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

試驗(yàn)得到9 株能在酪素培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明水解圈的菌株，挑選了其中1 株H/C 值大的作為試驗(yàn)的目標(biāo)菌株（圖1），H/C 值為5.45，在酪素培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)淡紅色、較大、呈圓形，光滑濕潤(rùn)。菌株編號(hào)為2021-9，以做進(jìn)一步研究。

菌株2021-9 透明圈見圖1。

圖1 菌株2021-9 透明圈

2.2 菌種鑒定

利用透明圈法從牛糞樣品中篩選出產(chǎn)蛋白酶的菌株2021-9。革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)為革蘭氏陰性菌，菌株為桿狀（圖2）。對(duì)菌株進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、糖類發(fā)酵試驗(yàn)、枸鹽酸試驗(yàn)等生理生化特性測(cè)定。根據(jù)該菌株的形態(tài)和生理特征，確定該菌株屬于Serratia 屬。

菌株 2021-9 革蘭氏染色結(jié)果見圖 2，菌株2021-9 的主要生理生化特性見表2。

表2 菌株2021-9 的主要生理生化特性

圖2 菌株2021-9 革蘭氏染色結(jié)果

利用通用引物27F 和1492R 擴(kuò)增菌株2021-9 的16S rDNA 序列用于測(cè)序分析，結(jié)果顯示該菌株的16S rDNA 核酸序列長(zhǎng)度為1 500 bp，將此序列與NCBI 的數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast 分析比對(duì)，顯示與Serratia marcescens 親緣關(guān)系最近，同源性為100%，因此可確定該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌。利用Mega 7.0軟件構(gòu)建16S rDNA 基因全序列為基礎(chǔ)的Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹。

基于16S rDNA 基因序列建立的菌株2021-9 系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。

圖3 基于16S rDNA 基因序列建立的菌株2021-9 系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 菌株生長(zhǎng)曲線

菌株2021-9 生長(zhǎng)曲線見圖4。

由圖4 可知，該菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為14 h 左右，在4~14 h 期間，菌株生長(zhǎng)迅速；14~18 h 時(shí)，菌株生長(zhǎng)較為緩慢；在14 h 以后，菌株生長(zhǎng)呈平緩衰退趨勢(shì)生長(zhǎng)，因此菌株數(shù)量最多的時(shí)期為14 h。

2.4 不同生長(zhǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4.1 不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

探究碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，設(shè)定的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉，圖5 為根據(jù)原液測(cè)得的吸光度稀釋5 倍后的結(jié)果。以蔗糖作為碳源時(shí)，菌株生長(zhǎng)情況達(dá)到最佳，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)以葡萄糖、麥芽糖、乳糖為碳源時(shí)，菌株的生長(zhǎng)情況較為良好，可以明顯看出淀粉不宜作為該培養(yǎng)菌株生長(zhǎng)的碳源。因?yàn)槠咸烟?、乳糖、蔗糖、麥芽糖都是單糖或者二糖，淀粉是多聚糖，相比多聚糖，菌株可能更容易直接利用單糖或者二糖，所以淀粉明顯不是適宜該菌株生長(zhǎng)所需要的碳源。

碳源對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響見圖5。

圖5 碳源對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響

2.4.2 不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在對(duì)該菌株進(jìn)行最適碳源研究后，在以蔗糖作為碳源的基礎(chǔ)上，探究氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，設(shè)定的氮源有胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、干酪素。圖6 為根據(jù)原液測(cè)得的吸光度值稀釋5 倍后的結(jié)果。以酵母粉作為氮源時(shí)，該菌液的吸光度值最高，菌株生長(zhǎng)情況最佳，而以干酪素作為該菌株生長(zhǎng)的氮源時(shí)吸光度值最低，因此酵母粉是該菌株最適宜生長(zhǎng)所需的氮源。干酪素的主要成分是酪蛋白[20]，相比于以上幾種作為氮源時(shí)，酪蛋白含量相對(duì)較多，可能是由于該菌株對(duì)酪蛋白的利用率低，因此干酪素是不適宜菌株2021-9 生長(zhǎng)。

氮源對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響見圖6。

圖6 氮源對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響

2.4.3 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在探究該菌株最適生長(zhǎng)的碳源、氮源分別為蔗糖、酵母粉的基礎(chǔ)上，設(shè)定5 個(gè)溫度梯度探究溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。圖7 為根據(jù)原液測(cè)得的吸光度值稀釋6 倍后的結(jié)果。該菌株最適生長(zhǎng)的溫度條件為39 ℃，最不適宜該菌株生長(zhǎng)的溫度條件為41 ℃。菌株2021-9 在低于41 ℃的情況下生長(zhǎng)都較為良好，而在以41 ℃為培養(yǎng)條件時(shí)，菌液的吸光度值明顯低于以其他溫度培養(yǎng)的菌液，說明該菌株可能適宜較低溫度環(huán)境下生長(zhǎng)。

溫度對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響見圖7。

圖7 溫度對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響

2.4.4 不同pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在探究該菌株最適生長(zhǎng)的碳源、氮源、溫度分別為蔗糖、酵母粉、39 ℃的基礎(chǔ)上，根據(jù)原培養(yǎng)基自然pH 值設(shè)定5 個(gè)pH 值梯度。圖8 為根據(jù)原液測(cè)得的吸光度值稀釋5 倍后的結(jié)果。該菌株最適生長(zhǎng)的pH 值是8.7，同時(shí)pH 值為4.7~7.7 時(shí)也適合該菌株的生長(zhǎng)，說明適宜菌株2021-9 生長(zhǎng)的pH 值范圍比較廣。

pH 值對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響見圖8。

圖8 pH值對(duì)菌株2021-9 生長(zhǎng)的影響

2.5 培養(yǎng)基對(duì)該菌株產(chǎn)酶的影響

2.5.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖9。

圖9 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定了其他發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基編號(hào)分別為A，B，C，D，E，F(xiàn)。由圖10 可知，F(xiàn) 號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力達(dá)到最大，最大酶活為29.834 U/mL，培養(yǎng)基A，B，E 發(fā)酵也有較大酶活。因此，最適宜該菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基組成為3.2%麩皮，3%黃豆粉，4%玉米粉，0.4%Na2HPO4，0.03%KH2PO4。

不同培養(yǎng)基對(duì)2021-9 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響見圖10。

圖10 不同培養(yǎng)基對(duì)2021-9 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

3 結(jié)論

從甘肅省蘭州市榆中縣崖灣奶牛場(chǎng)的牛糞中篩選出一株能夠產(chǎn)蛋白酶的菌株，編號(hào)為2021-9，經(jīng)革蘭氏染色、生理生化鑒定、16S rDNA 鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌。粘質(zhì)沙雷氏菌又稱為靈桿菌，廣泛存在于水、空氣、土壤、食品中，產(chǎn)生一種紅色的非擴(kuò)散性色素——靈菌紅素[21-22]，靈菌紅素是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種天然紅色素，具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫制劑等重要活性，在醫(yī)藥、環(huán)境、染料等方面具有重要應(yīng)用[23-24]。在靈菌紅素方面有多種研究，如李穎等人[25]從土壤中篩選出一株產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌PG12，確定菌株發(fā)酵合成靈菌紅素的條件26 ℃，pH 值7.5，發(fā)酵14 h后靈菌紅素量可達(dá)到最大值1 212.7 mg/L。Nguyen Van Bon 等人[26]以粘質(zhì)沙雷氏菌TNU02 為發(fā)酵菌體，脫礦蟹殼粉為原料低成本生產(chǎn)靈菌紅素。試驗(yàn)以牛肉湯為培養(yǎng)基，180 r/min，37 ℃的條件對(duì)2021-9 菌株進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)6 h 后該菌株達(dá)到最大生長(zhǎng)濃度，即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌株的前提下，探究碳源、氮源、溫度、pH 值對(duì)該菌株生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)最適該菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組成及條件為0.3%蔗糖，2%酵母粉，0.5% NaCl，pH 值8.7，溫度37 ℃。設(shè)定6 種培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到最優(yōu)培養(yǎng)基為3.2%麩皮，3%黃豆粉，4%玉米粉，0.4%Na2HPO4，0.03%KH2PO4，最大酶活可達(dá)29.834 U/mL。因此，后續(xù)工作可針對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步提高酶活提供一定的研究基礎(chǔ)。