HPLC法測定百仙婦炎清凝膠劑中苦參堿的含量

韓忠耀魯利民陸錦銳*

（1黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，都勻558000；2中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科，北京100091）

HPLC法測定百仙婦炎清凝膠劑中苦參堿的含量

韓忠耀1魯利民2陸錦銳1*

（1黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，都勻558000；2中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科，北京100091）

目的建立百仙婦炎清凝膠劑中苦參堿的含量測定方法。方法采用HPLC法測定百仙婦炎清凝膠劑中苦參堿的含量，選用Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長210 nm，流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀試液-0.2%三乙胺：乙腈（85:15），流速1.0 mL/min，柱溫35℃。結(jié)果苦參堿在0.13～2.34 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999）；平均回收率為98.35%，RSD=1.52%。結(jié)論所建立的方法準(zhǔn)確可靠，適合于測定百仙婦炎清凝膠劑中苦參堿的含量。同時(shí)，本方法操作簡便，靈敏度高，干擾少，重現(xiàn)性較好，可以作為百仙婦炎清凝膠劑的質(zhì)量控制方法。

百仙婦炎清凝膠劑；苦參堿；高效液相色譜法；質(zhì)量控制

百仙婦炎清凝膠劑是由百仙婦炎清栓改劑型而來的中藥八類新藥。百仙婦炎清凝膠劑主要由苦參、百部、蛇床子、仙鶴草、紫珠葉、白礬、冰片、樟腦、硼酸等藥材制成的中藥復(fù)方制劑。全方共奏清熱解毒、殺蟲止癢、去瘀等功效，主要用于霉菌性、細(xì)菌性、滴蟲性陰道炎和宮頸糜爛。

改成凝膠劑后，與栓劑相比，其優(yōu)點(diǎn)是：首先，水溶性的凝膠比栓劑使用時(shí)潔凈度更高，不污染衣物；其次，局部藥物濃度高，與病灶接觸面積大，能夠全面覆蓋陰道粘膜，不留死角；然后，陰道內(nèi)給藥，直接作用于患處；同時(shí)，該劑型給藥方便，陰道內(nèi)滯留性好，藥物作用時(shí)間長，無刺激，無異物感。通過處方制劑等研究，產(chǎn)品穩(wěn)定，質(zhì)量可控、安全、使用與攜帶方便，證明所選的劑型合理可行。

目前百仙婦炎清凝膠劑研究報(bào)道中［1-6］，尚無針對(duì)百仙婦炎清凝膠劑方中君藥苦參的主要活性成分苦參堿的含量控制的研究。本研究結(jié)合2010版（《中國藥典》一部）［7］與相關(guān)文獻(xiàn)，旨在探討百仙婦炎清凝膠劑中苦參堿的含量測定方法，為百仙婦炎清凝膠劑制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；博納艾杰爾Promosil C18色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm）；Sartorius BP211D型分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥苦參堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110805-200507）；百仙婦炎清凝膠（批號(hào)：20131201、20131202、20131203，實(shí)驗(yàn)室自制）；色譜純乙腈（天津康科德科技有限公司）；磷酸為分析純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件流動(dòng)相：0.02 mol/l磷酸二氫鉀試液-0.2%三乙胺：乙腈（85∶15）；檢測波長：210 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按苦參堿峰（C15H24N2O）計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備取苦參堿對(duì)照品，加甲醇溶解，制成每1 mL含苦參堿0.26 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備溶液。

2.3 供試品溶液的制備取樣品適量，精密稱定百仙凝膠劑0.5 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇24 mL，超聲提取30分鐘，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的制備按處方比例及工藝制備缺苦參藥材的陰性對(duì)照品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)分別吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液及百仙婦炎清凝膠供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測定，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰，表明其它組分對(duì)測定無干擾，見圖1，1為苦參堿峰。

圖1 百仙婦炎清凝膠HPLC

2.6 線性關(guān)系的考察精密吸取苦參堿對(duì)照品溶液（0.26 mg·mL-1）0.5，1，3，5，7，和9 mL，置于6個(gè)10 mL量瓶中，分別用甲醇定容至刻度；在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算，得回歸方程Y=405.72X+17.145，r=0.9999。結(jié)果表明苦參堿進(jìn)樣量在0.13～2.34 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 苦參堿線性考察

2.7 精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積RSD為0.75%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液分別在0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算得RSD為1.29%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批制劑，按供試品溶液制備方法制備6份溶液，在上述色譜條件下測定，計(jì)算苦參堿含量，RSD為0.94%。

2.10 回收率試驗(yàn)采用加樣回收法，精密稱取已知含量的本品半量約0.25 g，置25 mL量瓶中，分別精密吸取對(duì)照品溶液（濃度0.0999 mg/ml，3.5，6，8.5 mL，各3份，加入含樣品0.25 g的量瓶中，（加入對(duì)照品的量相當(dāng)于全量的80%、100%、120%），按含量測定項(xiàng)下，分別測定苦參堿的含量，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜峰，計(jì)算回收率。結(jié)果見下表。

表1 加樣回收率考察表

2.11 含量測定百仙婦炎清凝膠劑三批樣品（批號(hào)：20131201、20131202、20131203，實(shí)驗(yàn)室自制）測定按上述色譜條件對(duì)3批樣品進(jìn)行分析，以外標(biāo)法計(jì)算苦參堿含量，含量測定結(jié)果如下：

表2 百仙婦炎清凝膠含量檢測結(jié)果

3 討論

趙玉絨［2］等采用NH2色譜柱測定百仙婦炎清陰道泡騰片中苦參堿的含量，由于NH2色譜柱價(jià)格昂貴，較特殊，所以將其改成價(jià)格低廉、常用的C18色譜柱，為檢測提供便利條件，更符合實(shí)際工作需要。汪暐東［3］以乙腈-0.025 mol×L-1硫酸銨-十二烷基硫酸鈉（30:70: 0.6）（用硫酸（1→5）溶液調(diào)節(jié)pH至3.0）為流動(dòng)相，梅璇［4］等以磷酸緩沖溶液（0.2%三乙胺水溶液1000 mL，用磷酸調(diào)pH 3.5）-乙腈（96∶4）為流動(dòng)相，均需用酸調(diào)節(jié)溶液的pH，操作較復(fù)雜，本文為流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀試液-0.2%三乙胺：乙腈（85∶15），實(shí)驗(yàn)操作簡單，方便。

本品在進(jìn)行波長選擇時(shí)，稱取苦參堿對(duì)照品適量，用甲醇溶解后做紫外掃描，測得最大吸收波長為201.9 nm，因此，波長有末端吸收，有干擾，參照結(jié)果最終選定210 nm作為百仙婦炎清凝膠劑檢測波長。

3.1 提取溶劑考察取本品（批號(hào)：20131201）4份，置于25 mL量瓶中，分別加入甲醇、無水乙醇、2%氨性氯仿、流動(dòng)相約24 mL，超聲處理30分鐘后，取出，放冷，加提取溶劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液為供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，各提取溶劑下苦參堿含量測定結(jié)果見表3。

表3 提取溶劑考察結(jié)果表

由以上結(jié)果可見，苦參堿含量大小順序依次為：甲醇提取＞無水乙醇提?。?%氨性氯仿提取。同時(shí)，流動(dòng)相提取的樣品，由于凝膠劑中輔料的溶解而難以濾過，所以最終確定甲醇為本品的提取溶劑。

3.2 提取方法考察

3.2.1 超聲提取法取本品（批號(hào)：20131201），置25 mL量瓶中，加甲醇約24 mL，超聲處理30分鐘，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液為供試品溶液，進(jìn)樣10 μL。

3.2.2 回流提取法取本品（批號(hào)：20131201），置50 mL三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，水浴加熱回流提取30 min，放冷，稱重，補(bǔ)足甲醇，搖勻，用0.45 μm膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液為供試品溶液，進(jìn)樣10 μL。結(jié)果見表4。

表4 提取方法考察結(jié)果表

由以上結(jié)果可見，超聲提取的苦參堿含量高于回流提取，且方法簡便，所以確定以超聲提取為本品的提取方法。

3.2.3 提取時(shí)間考察取本品（批號(hào)：20131201）3份，置25 mL量瓶中，加甲醇約24 mL，分別超聲處理10、 30、60 min，使溶解，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液為供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果見表5。

表5 提取時(shí)間考察表

由以上結(jié)果可見，超聲提取30 min已提取完全，檢測到的苦參堿的含量幾乎無變化，表明此時(shí)苦參堿已經(jīng)提取徹底，所以確定以超聲30 min為本品的提取方法。

將百仙婦炎清栓改制成百仙婦炎清凝膠，可減少刺激性，更便于臨床應(yīng)用。通過HPLC法測定百仙婦炎清凝膠中的君藥苦參的主要活性成分苦參堿進(jìn)行含量測定，可為百仙婦炎清凝膠質(zhì)量控制及制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)與借鑒。

［1］程雪翔.HPLC測定百仙婦炎清凝膠中蛇床子素的含量［J］.中國中藥雜志，2007，32（12）:1227-1229.

［2］趙玉絨，郭永逹.百仙婦炎清陰道泡騰片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2009，24（6）:460-462.

［3］汪暐東.HPLC測定百仙婦炎清栓中的苦參堿含量［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12（12）:1154-1155.

［4］梅璇，劉致珍.反相高效液相色譜法測定百仙婦炎清栓中的苦參堿含量［J］.貴州醫(yī)藥，2006，30（10）:937-938.

［5］梁藝英，朱炳輝，方繼輝，等.苦參堿葡萄糖注射液中苦參堿的含量測定［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2004，21（5）:399-401.

［6］劉慶豐，李中東，施孝全，等.高效液相色譜法測定除濕注射劑中的三種成分［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24（5）:412-413.

［7］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：188．

Content Determination of Matrine in Baixian Fuyanqing Ningjiao by HPLC

HAN Zhongyao1，LU Limin2，LU Jinrui1*
（1 Department of Pharmacy，Qiannan Medical College for Nationalities，Guizhou Province，Duyun558000，China；2 Pharmacy Department，Xiyuan Hospltal CACMS，Beijing100091，China）

Objective Establish the method for the content determination of matrine in Baixian Fuyanqing Ningjiao.Methods The matrine content of Baixian Fuyanqing Ningjiao was determined by HPLC with Promosil C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was 0.02 mol/L Potassium dihydrogen phosphate-0.2% triethylamine:acetonitrile（85∶15），and the detection wavelength was 210 nm，the flow rate was 1 mL/min，the column temperature was 35℃.Results The calibration curve was linear over the range of 0.13～2.34 μg（r=0.9999）for matrine.The average recovery rate was 98.35%，RSD=1.52%.Conclusion This method has good characteristics and is suitable for the content determination of matrine in Baixian Fuyanqing Ningjiao.Meanwhile，this method is simple，sensitive and reproducible.It can be used for the quality control of the Baixian Fuyanqing Ningjiao.

Baixian Fuyanqing Ningjiao；matrine；HPLC；quality control

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.06.071

1672-2779（2015）-06-0140-03

楊杰 本文校對(duì)：楊杰

2015-01-30）

*通訊作者：lujinrui89@126.com