miR－18b增強乳腺癌MDA－MB－231細胞對順鉑化療敏感性的作用及其機制

陳竟男，王 楊，金東輝，盧曉梅

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院特需病房，吉林 長春 130033；2.武警吉林省總隊醫(yī)院內(nèi)一科，吉林 長春 130052）

RNA干擾是在動植物中普遍存在的機制，RNA干擾在不同水平對基因的表達進行調(diào)控。在這些 RNA中，小非編碼RNA （microRNA，miRNA），參與基因的表達調(diào)控，其基因的改變不僅在腫瘤的起始和發(fā)展中扮演重要的角色，而且還參與調(diào)控腫瘤的放化療敏感性［1－2］。最新研究［3］表明：miR－18b在乳腺癌細胞系中表達水平升高，是調(diào)節(jié)乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因。而miR－18b在乳腺癌的化療過程中的生物學(xué)作用及其機制尚不清楚。本研究旨在闡明miR－18b調(diào)節(jié)乳腺癌細胞MDA－MB－231的化療敏感性的可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 人乳腺癌細胞MDA－MB－231購自上海復(fù)祥生物有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基及新生胎兒牛血清購自杭州四季青公司，miR－18bmimics及其抑制劑購自蘇州吉瑪公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，Dual－Luciferase Report Assay購自美國Promega公司，miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒購自中國大連Takara公司，兔抗人Anti－ATM抗體購自英國Abcam公司，GAPDH購自美國Santa公司，羊抗兔購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，順鉑 （DDP）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用DMEM培養(yǎng)液將DDP配成20mg·L－1溶液儲存于4℃恒溫，用時稀釋到需要的濃度。低溫高速離心機MTX－150型購自日本TOMY公司，CO2孵箱購自日本SANYO公司，Mini Trans－Blot電泳轉(zhuǎn)移儀購自美國Bio－Rad公司，JA1203電子天平購自上海精科公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞 MDA－MB－231于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2和100%飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合達到70%以上，胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的 MDA－MB－231細胞以每孔2×105種于6孔板中，使之第2天達到60%密度。轉(zhuǎn)染前吸走舊培養(yǎng)液，每孔加雙陰 性 培 養(yǎng) 液 1mL。混 合 A 液：5μL（20μmol·L－1）mimc／NC （陰性對照）＋200μL RPMI1640 （－／－ ）。 混 合 B 液：5 μL Lipofectamine 2000＋200μL RPMI1640（－／－）。將A和B液混勻，室溫放置20min。將混合液滴入6孔板，3h后補液1mL。轉(zhuǎn)染后4h給予0.1、1.0和10.0mg·L－1DDP處理。分別為 MDAMB－231組、MDA－MB－231＋DDP組、MDA－MB－231－NC組、MDA－MB－231－NC＋DDP 組、MDAMB－231mimic組和 MDA－MB－231mimic＋DDP組轉(zhuǎn)染后48h提取細胞的RNA。

1.4 miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測 使用PicTar、DIANA LAB 和 TargetScanHuman 5.1的3個靶基因預(yù)測網(wǎng)站，對miRNA－18b的靶基因進行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果匯總后，以2或3個網(wǎng)站均預(yù)測出的靶基因視為有效靶基因。

1.5 熒光素酶載體構(gòu)建 ATM 3′UTR上游引物：5′－GCCTCTAGACTCCTGTTCTGTTCAAGTAT－3′；下游引物：5′－GGCCCTCTAGAGCTTTTAGAATTATTTATTC－3′；PCR 法 調(diào) 取 目 的片段，酶切回收ATM片段，3′UTR片段與目的載體連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取單菌落，擴增，提取質(zhì)粒。送公司測序，確定質(zhì)粒序列正確。

1.6 熒光素酶報告基因分析 細胞接種于24孔板，每孔轉(zhuǎn)染30ng pMIR－ATM 3′UTR和4ng pRL－SV40，并同時共轉(zhuǎn)染100nmol·L－1miR－18b mimic或NC，每孔轉(zhuǎn)染3復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后48h應(yīng)用Dual－Luciferase Report Assay檢測試劑盒檢測螢燭熒光素酶 （firely luciferase activity）和海腎熒光素酶 （Renilla luciferase activity）的值。以兩者的比值為熒光素值。

1.7 qRT－PCR 法 檢 測 MDA－MB－231 細 胞 中miR－18b的表達水平 按照Trizol reagent說明書進行MDA－MB－231細胞的RNA抽提。純度、濃度和完整性均合格的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。按照miScript SYBR Green PCR Kit說明書，反應(yīng)條件：95℃、30s，1個循環(huán)；95℃、20s，60℃、30s，45個循環(huán)。結(jié)果采用比較閾值法2－△△CT計算，△△CT＝ （實驗組目的基因Ct－實驗組管家基因Ct）－ （對照組目的基因Ct－對照組管家基因Ct）。

1.8 Western blotting法檢測 MDA－MB－231細胞中ATM蛋白的表達水平 分裝蛋白樣品105℃變性5min。電泳條件：80V、2～3h，100V、90min，濕轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉1h，一抗過夜，1×TBS洗3次，一次洗10min。二抗作用1h，1×TBS洗3次，一次洗10min?；瘜W(xué)發(fā)光液作用1min，曝光。采用Quantity one軟件進行灰度分析，ATM蛋白表達水平＝目的條帶灰度值／GAPDH灰度值。

1.9 CCK－8法檢測細胞生長抑制率 將轉(zhuǎn)染后24h的活細胞制備成單細胞懸液，計數(shù)活細胞后，接種于96孔板 后，將 MDA－MB－231NC 組 和MDA－MB－231mimic組細胞分別給予不同劑量（0.1、1.0 和 10.0mg·L－1）DDP 處理，調(diào)整終體積為100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入10μL CCK－8試劑，37℃、5%CO2條件下孵育1～3h，用酶標(biāo)儀測定450nm波長處吸光度 （A）值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率＝ （1－實驗組A值／對照組 A值）×100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。熒光素酶活性、細胞生長抑制率、各組 MDA－MB－231細胞中 miR－18b表達水平和ATM蛋白表達水平結(jié)果均以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR－18b靶基因的預(yù)測 通過miRNA預(yù)測靶基因的生物信息學(xué)方法初步預(yù)測miR－18b的靶基因。見圖1。

圖1 生物信息學(xué)法預(yù)測miR－18b靶基因示意圖Fig.1 Schematic diagram of target genes of miR－18bpredicted by bioinformatics method

2.2 MDA－MB－231細胞中 ATM 3′UTR 載體熒光素 酶 活 性 與 MDA－MB－231－NC 組 （1.00±0.04） 比 較，MDA－MB－231＋ mimic 組 pMIRATM熒光素酶活性的相對值 （0.64±0.08）明顯降低 （P＜0.05）。

2.3 MDA－MB－231細胞中 miR－18b的表達水平實時定量PCR法檢測乳腺癌MDA－MB－231細胞中miR－18b的相對表達水平，與 MDA－MB－231組比較， MDA－MB－231 ＋ DDP 組、 MDA－MB－231 mimic組和 MDA－MB－231mimic＋DDP組細胞中miR－18b的表達水平明顯升高 （P＜0.05）。與MDA－MB－231－NC 組 比 較，MDA－MB－231mimic組細胞中 miR－18b表達水平升高20倍以上，MDA－MB－231mimic＋DDP組細胞中 miR－18b表達水平升高60倍以上 （P＜0.05）。見表1。

表1 各組 MDA－MB－231細胞中miR－18b表達水平Tab.1 Expression levels of miR－18bin MDA－MB－231cells in various groups （）

表1 各組 MDA－MB－231細胞中miR－18b表達水平Tab.1 Expression levels of miR－18bin MDA－MB－231cells in various groups （）

＊ P＜0.05compared with MDA－MB－231group；△ P＜0.05 compared with MDA－MB－231－NC group.

Group Expression level of miR－18b MDA－MB－231 1.00±0.00 MDA－MB－231＋DDP 4.32±0.41＊MDA－MB－231－NC 1.83±0.03 MDA－MB－231mimic 40.21±0.15＊△MDA－MB－231mimic＋DDP 112.32±0.13＊△

2.4 MDA－MB－231細胞中ATM蛋白的表達 與MDA－MB－231組 比 較，MDA－MB－231 ＋ DDP 組細胞中ATM蛋白表達水平明顯增加 （P＜0.05）；與 MDA－MB－231－NC 組 比 較， MDA－MB－231 mimic組細胞中ATM蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與 MDA－MB－231－NC＋DDP組比較，MDA－MB－231mimic＋DDP組細胞中 ATM 蛋白表達水平進一步降低 （P＜0.05）。見圖2和表2。

圖2 各組MDA－MB－231細胞中ATM蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of ATM protein protein in MDA－MB－231cells in various groups

表2 各組MDA－MB－231細胞中ATM蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of ATM protein in MDA－MB－231 cells in various groups （）

表2 各組MDA－MB－231細胞中ATM蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of ATM protein in MDA－MB－231 cells in various groups （）

＊ P＜0.05compared with MDA－MB－231group；△ P＜0.05 compared with MDA－MB－231－NC group；#P＜0.05compared with MDA－MB－231－NC＋DDP group.

Group Expression level of ATM protein MDA－MB－231 1.00±0.08 MDA－MB－231＋DDP 2.20±0.06＊MDA－MB－231－NC 1.00±0.12 MDA－MB－231mimic 0.63±0.11△MDA－MB－231－NC＋DDP 1.00±0.16 MDA－MB－231mimic＋DDP 0.49±0.09#

2.5 各組 MDA－MB－231細胞生長抑制率 經(jīng)不同 濃 度 DDP 處 理 后， 與 MDA－MB－231－NC 組（33.0% ±12.0%、40.0% ±9.0%、65.0% ±11.0%）比較，MDA－MB－231mimic組 MDA－MB－231細胞生長的抑制率 （38.0%±9.0%、52.0%±8.0%、71.0%±10.0%）均增高，說明轉(zhuǎn)染miR－18amimic后，MDA－MB－231細胞對 DDP化療敏感性升高。

3 討 論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一，同時也是全世界女性發(fā)病率最高的癌癥，根據(jù)美國最新的癌癥統(tǒng)計資料［4］顯示：美國2013年的乳腺癌發(fā)病率仍占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第1位，死亡率第2位，在我國乳腺癌發(fā)病率也有逐年上升的趨勢。目前認(rèn)為在乳腺癌治療中，雌激素受體（ER）、孕激素受體 （PR）和生長因子受體（HRE2）的表達是預(yù)后的重要指標(biāo)，而三者均呈陰性表達的乳腺癌是一種特殊亞型，與其他乳腺癌亞型比較，采用內(nèi)分泌治療及針對HER2的分子靶向藥物治療方法均無效［5－6］，目前針對該亞型的治療手段仍為全身化療。Sirohi等［7］報道三陰性乳腺癌對以鉑類為基礎(chǔ)的化療方式敏感，病理完全緩解率為88%。Garber等［8］進行的臨床試驗觀察鉑類在三陰性乳腺癌中的療效，也發(fā)現(xiàn)DDP治療乳腺癌的臨床有效率和病理緩解率高，毒副作用少。以鉑類為基礎(chǔ)的新輔助化療與非鉑類方案治療局部晚期三陰性乳腺癌患者，含鉑類方案的療效優(yōu)于非鉑類方案，以上研究均表明DDP在三陰性乳腺癌化療中有效。因此在保證患者生命質(zhì)量前提下，提高DDP對三陰性乳腺癌的化療敏感性、增強DDP對三陰性乳腺癌細胞的殺傷作用、改善患者預(yù)后和延長生存期成為目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點。

miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，參與了相關(guān)基因調(diào)控的一系列過程，扮演著重要角色。石永國等［9］研究表明：miR－206能顯著抑制三陰性乳腺癌MDA－231細胞的增殖能力，其深層機制可能和細胞周期蛋白cyclin D2表達下調(diào)有關(guān)聯(lián)。Zhao等［10］研究證實：靶向抑制腫瘤抑制基因miR－450b－3p能有效地抑制乳腺癌細胞的增殖。Bischoff等［11］發(fā)現(xiàn)：下調(diào)miR－149能通過激活Rac來促進腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移，而增加miR－149的表達水平則抑制了乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移。項丹等［12］發(fā)現(xiàn)：DDP聯(lián)合西達本胺能顯著降低三陰性乳腺癌MDA－MB－231細胞中切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC1）的表達水平，從而在體外發(fā)揮抑制其增殖分裂的作用。而張夢怡等［12］研究顯示：DDP聯(lián)合多肽P161能增加乳腺癌細胞株的化療敏感性，其機制可能與細胞早期凋亡有密切關(guān)聯(lián)。

miR－18b是一種參與基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子［14－17］，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的機制尚未明確。本研究顯示：轉(zhuǎn) 染 miR－18bmimic 后，MDA－MB－231 細 胞 中miR－18b的表達水平顯著高于對照組，且上調(diào)程度呈劑量依賴性。而過表達miR－18b可以增強MDAMB－231細胞的化療敏感性。本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測靶基因，雙熒光素酶基因報告驗證靶基因，Western blotting方法檢測 MDA－MB－231細胞中miR－18b和ATM蛋白的表達，初步驗證了ATM可能是miR－18b的靶基因。本實驗的意義在于首次證實過表達miR－18b可以顯著提高乳腺癌細胞對DDP的化療敏感性，其機制可能通過調(diào)控ATM來發(fā)揮作用。

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