HPLC法測(cè)定抗毒合劑中綠原酸的含量

鄧松岳王迎舉

（1河南省商丘市食品藥品檢驗(yàn)所，商丘476000；2河南省藥品審評(píng)認(rèn)證中心，鄭州450004）

HPLC法測(cè)定抗毒合劑中綠原酸的含量

鄧松岳1王迎舉2

（1河南省商丘市食品藥品檢驗(yàn)所，商丘476000；2河南省藥品審評(píng)認(rèn)證中心，鄭州450004）

目的建立抗毒合劑中綠原酸的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法，色譜條件為：色譜柱：ZORBAX SBC18；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（15∶85）；流速：0.8 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm。結(jié)果綠原酸在0.0904～0.904 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1.0000），平均回收率為98.29%，RSD=1.06%（n=6）。結(jié)論本方法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于抗毒合劑的質(zhì)量控制。

綠原酸；高效液相色譜法；抗毒合劑

抗毒合劑（豫藥制字Z20120594（鄭）），是由金銀花、大青葉、板藍(lán)根、連翹、柴胡、葛根六味藥材加工制成的復(fù)方制劑，具有清熱涼血、解毒消腫之功效，主治各種感冒、發(fā)熱、病毒性腮腺炎、扁桃體炎、咽炎及急性支氣管炎。方中君藥金銀花，又名忍冬（學(xué)名：Lonicera japonica）?！敖疸y花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開(kāi)為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。藥材金銀花為忍冬科植物忍冬干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥。它性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪。金銀花既能宣散風(fēng)熱，還善清解血毒，用于各種熱性病，如身熱、發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等癥，均效果顯著。金銀花自古以來(lái)就以它的藥用價(jià)值廣泛而著名。其功效主要是清熱解毒，主治溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰疽疔毒等。現(xiàn)代研究證明，金銀花含有綠原酸、木犀草素苷等藥理活性成分，對(duì)溶血性鏈球菌、金黃葡萄球菌等多種致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有較強(qiáng)的抑制力，另外還可增強(qiáng)免疫力、抗早孕、護(hù)肝、抗腫瘤、消炎、解熱、止血（凝血）、抑制腸道吸收膽固醇等，其臨床用途非常廣泛，可與其它藥物配伍用于治療呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系統(tǒng)感染、高血壓等40余種病癥。

金銀花性寒，味甘，入肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、抗炎、補(bǔ)虛療風(fēng)的功效，主治脹滿下疾、溫病發(fā)熱，熱毒癰瘍和腫瘤等癥。其對(duì)于頭昏頭暈、口干作渴、多汗煩悶、腸炎、菌痢、麻疹、肺炎、乙腦、流腦、急性乳腺炎、敗血癥、闌尾炎、皮膚感染、癰疽疔瘡、丹毒、腮腺炎、化膿性扁桃體炎等病癥均有一定療效。

金銀花藥用價(jià)值和保健用途廣泛，社會(huì)需求量大。金銀花的成色不同，藥用效果也不同。因此控制制劑中金銀花品質(zhì)的優(yōu)劣，是關(guān)系到制劑功效的關(guān)鍵所在。但抗毒合劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)目，無(wú)法從定量的角度控制藥品質(zhì)量，確保該制劑的療效，本文以方中君藥金銀花的有效成分綠原酸為指標(biāo)成分［1］，建立了抗毒合劑中綠原酸的高效液相測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，準(zhǔn)確，可作為抗毒合劑的質(zhì)量控制方法。

在進(jìn)行質(zhì)量研究的過(guò)程中，一項(xiàng)重要的工作就是要對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所涉及到的分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以保證所用的分析方法確實(shí)能夠用于在研藥品的質(zhì)量控制。本文按照《中國(guó)藥典》2010年版附錄方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則中要求的項(xiàng)目進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果滿意。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，AUW-220D電子分析天平，5210DT超聲處理器；綠原酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753-200413）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑為分析純?？苟竞蟿ê幽鲜∪嗣襻t(yī)院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 um）

流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（15∶85）為流動(dòng)相；流速0.8 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 線性關(guān)系考察線性關(guān)系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5份供試樣品。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算。

取綠原酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加50%甲醇適量，振搖使完全溶解后，稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 ml置10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、14、16、20 μl，記錄綠原酸峰面積值，以峰面積積分值（Y）對(duì)對(duì)照品進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=3492.1X-2.2747，r=1.0000。結(jié)果表明，綠原酸對(duì)照品進(jìn)樣量在0.0904～0.904 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 對(duì)照品溶液的制備取綠原酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加50%甲醇適量，振搖使完全溶解后，稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備精密量取本品2 ml，置10 ml量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲處理30分鐘（功率250 W，頻率35 KHZ），放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取缺金銀花的其他味藥按處方工藝制成陰性制劑，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 干擾試驗(yàn)取上述3種溶液，按照上述色譜條件，分別注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明供試品溶液在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，有相應(yīng)的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 精密度試驗(yàn)精密度系指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μl，記錄峰面積，RSD=0.99%（n=5），表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)按照分析方法分別配置供試品溶液，按照一定的時(shí)間間隔測(cè)定主成分的含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測(cè)定，RSD=0.97%，供試品溶液在10小時(shí)內(nèi)峰面積基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般以回收率（%）表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。本文采用加樣回收率試驗(yàn)，具體操作如下：

精密量取已知含量的供試品（含量為0.1963 mg/ ml）1.00 ml，6份，分別置10 ml量瓶中，另分別精密加入對(duì)照品溶液（濃度為0.2011 mg/ml）1.00 ml，制備成供試品溶液，分別測(cè)定綠原酸的含量，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定取3批樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試液，各進(jìn)樣10 μl，按外標(biāo)法計(jì)算綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批樣品中綠原酸的含量

3 討論

綠原酸是金銀花的有效成分之一，也是金銀花的主要抗菌、抗病毒有效藥理成分之一。綠原酸具有較廣泛的抗菌作用，但在體內(nèi)能被蛋白質(zhì)滅活。與咖啡酸相似，口服或腹腔注射時(shí)，可提高大鼠的中樞興奮性；可增加大鼠及小鼠的小腸蠕動(dòng)和大鼠子宮的張力，有利膽作用，能增進(jìn)大鼠的膽汁分泌，對(duì)人有致敏作用，吸入含有本品的植物塵埃后，可發(fā)生氣喘、皮炎等。本文采用高效液相色譜法對(duì)綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定，綠原酸的紫外吸收?qǐng)D譜顯示，其在327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇327 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

本文參考有關(guān)文獻(xiàn)［2-4］，供試品的制備分別采用回流0.5 h、1 h、2 h提取，超聲10 min、30 min、1 h提取，試驗(yàn)結(jié)果表明超聲處理30 min提取較為完全，且操作簡(jiǎn)便快捷，故采用超聲提取30 min。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：205.

［2］郭凡嶺，申鳳菊，申海榮.HPLC法測(cè)定復(fù)方羅布麻片中綠原酸和蒙花苷的含量［J］.中國(guó)藥事.2010.24（5）：444-446.

［3］余衛(wèi)兵，畢雪艷，張鋼平，等.HPLC法測(cè)定臁瘡?fù)柚芯G原酸的含量［J］.中國(guó)藥師，2007，10（12）：1270-1271.

［4］李澤玲，付瑛，陳雅寧.HPLC法同時(shí)測(cè)定茵梔黃分散片中綠原酸與梔子苷的含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（6）：42-44.

識(shí)別真假木瓜

木瓜又名皺皮木瓜、鐵腳梨，為薔薇科植物貼梗海棠的成熟干燥果實(shí)，載入《名醫(yī)別錄》，《本草綱目》中李時(shí)珍引宋代藥物學(xué)家蘇頌語(yǔ)：“木瓜處處有之，而宣城者為佳，木狀如柰。春末開(kāi)花，深紅色。其實(shí)大者如瓜，小者如拳，上黃似著粉?！泵磕?～10月采收成熟的果實(shí)，置沸水中煮5～10分鐘后撈出，曬至外皮起皺時(shí)，縱剖為2或4塊，再曬至顏色變紅為度。若白天日曬，晚間夜露經(jīng)霜，則顏色更加鮮艷。

木瓜性溫，味酸，入肝、脾經(jīng)，具有平肝和胃、去濕舒筋的功效，用于治療吐瀉轉(zhuǎn)筋、濕痹、腳氣、水腫、痢疾等癥?！侗静菡份d：“木瓜，用此者用其酸斂，酸能走筋，斂能固脫，得木味之正，故尤專入肝益筋走血。療腰膝無(wú)力，腳氣，引經(jīng)所不可缺，氣滯能和，氣脫能固。以能平胃，故除嘔逆、霍亂轉(zhuǎn)筋，降痰，去濕，行水。以其酸收，故可斂肺禁痢，止煩滿，止渴?！笔袌?chǎng)上有以同科植物榠楂冒充木瓜。蘇頌曾曰：“榠楂木葉花實(shí)酷類(lèi)木瓜，但比木瓜大而黃色，辨之惟看蒂間，別有重蒂如乳者為木瓜，無(wú)此則榠楂也?！贝藰i楂即為光皮木瓜，使用時(shí)注意鑒別。

真品木瓜干燥果實(shí)呈長(zhǎng)圓形，?？v剖為卵狀半球形，長(zhǎng)4～8厘米，寬3．5～5厘米，厚2～8毫米，外皮棕紅色或紫紅色，微有光澤，常有皺褶，邊緣向內(nèi)卷曲；質(zhì)堅(jiān)硬，剖開(kāi)面呈棕紅色，平坦或有凹陷的子房室，種子大多數(shù)脫落，有時(shí)可見(jiàn)子房隔壁；種子三角形，紅棕色，內(nèi)含白色種仁1粒；聞之氣微，口嘗味酸澀。

偽品榠楂干燥果實(shí)呈月牙形或類(lèi)長(zhǎng)橢圓形，多縱剖成2～4瓣，表面平滑或稍粗糙無(wú)皺褶，有極細(xì)的皺紋，呈紅棕色，光滑無(wú)皺紋，久存后為紫棕色，兩端平或微翹，邊緣微內(nèi)曲，剖面平坦或微凹；果肉較厚，呈紅棕色，粗糙，顯顆粒性；中心子房室明顯，內(nèi)含種子多數(shù)，種子扁平三角形，排列緊密，為紅棕色；質(zhì)堅(jiān)硬而重，聞之氣微香，口嘗味酸澀，嚼之有砂粒感。偽品榠楂雖與木瓜為同科植物，但不具備木瓜的各項(xiàng)功效，從理化鑒定的各項(xiàng)指標(biāo)看，與真品木瓜也有較大的差異，故《中國(guó)藥典》1985年版開(kāi)始僅收載薔薇科植物皺皮木瓜一種，棄去同科屬植物榠楂，不作木瓜藥用，臨床用藥必須仔細(xì)鑒別。

——摘自《中國(guó)中醫(yī)藥報(bào)》

Determination of Chlorogenic Acid in Antitoxic Mixture by HPLC

DENG Songyue1，WANG Yingju2
（1 Shangqiu Institute of Food and Drug Inspection，Henan Province Shangqiu476000，China；2 Drug Approval Certification Center of Henan Province，Zhengzhou 450004，China）

Objective To set up a method to determination of chlorogenic acid in antitoxic mixture.Methods The content of chlorogenic acid determined by HPLC.The chromatographic system consisted of C18 column，using acetonitrile-0.4%phosphate solution（15∶85）as mobile phase.The content was detected at a waveleng of 327 nm，the flow rate was 0.8 ml·min-1.Results The chlorogenic acid have a good tincar rolatim in the range of 0.0904～0.904 ug（r=1.0000），the average recovery was 98.29%and RSD=1.06%（n=6）.Conolusion The established method is simple，sensitive and accuracy.It can be used for quality control of antitoxic mixture.

chlorogenic acid；HPLC；antitoxic mixture

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.09.066

1672-2779（2015）-09-0131-03

：張文娟本文校對(duì)：王正波

2015-03-20）