健骨伸筋湯對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨病理改變及關(guān)節(jié)液IL-1β及NO含量的影響※

劉洪波靖春穎*謝毅強(qiáng)韓平

（1海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，海口571199；2海南醫(yī)學(xué)院科研處，?？?71199；3海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，?？?70102）

健骨伸筋湯對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨病理改變及關(guān)節(jié)液IL-1β及NO含量的影響※

劉洪波1靖春穎1*謝毅強(qiáng)2韓平3

（1海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，?？?71199；2海南醫(yī)學(xué)院科研處，海口571199；3海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，?？?70102）

目的觀察健骨伸筋湯對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨病理改變及關(guān)節(jié)液IL-1β及NO含量的影響。方法45只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組9只。通過改良的Hulth法制成腎虛型大鼠的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，2周后，對(duì)空白對(duì)照組、模型組生理鹽水灌胃；治療組分低、高濃度進(jìn)行中藥灌胃，于灌胃后第7周、13周各組隨機(jī)挑選一半觀察大鼠膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨病理改變及關(guān)節(jié)液IL-1β及NO含量的變化。結(jié)果造模后大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨評(píng)分遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，軟骨破壞嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）；經(jīng)治療后，評(píng)分均有所降低，IL-1β和NO含量有所改善，說明治療對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨有修復(fù)作用，健骨伸筋湯低劑量組、高劑量組與壯骨關(guān)節(jié)丸組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論健骨伸筋湯可降低IL-1β和NO含量，有一定的關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用，可一定程度地延緩膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型軟骨的退變。

健骨伸筋湯；膝關(guān)節(jié)炎；軟骨修復(fù)

健骨伸筋湯是治療膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)長(zhǎng)期的臨床運(yùn)用及觀察發(fā)現(xiàn)，健骨伸筋湯可減緩骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展［1］。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)制KOA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法，從觀察關(guān)節(jié)軟骨病理改變及關(guān)節(jié)液IL-1β及NO含量等指標(biāo)的角度入手，深入研究健骨伸筋湯治療KOA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45只雌性健康4月齡SD大鼠，空腹體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012），為SPF級(jí)動(dòng)物。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑健骨伸筋湯：由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備，按人與動(dòng)物體表面積折算等效計(jì)量比值折算成大鼠生藥量。濃縮含生藥2 g/ml，4℃保存。IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒和NO試劑盒（硝酸還原酶法）購(gòu)自海南綠葉生物制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組45只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組9只：A組（空白對(duì)照組）、B組（造模組）、C組（壯骨關(guān)節(jié)丸組）、D組（健骨伸筋湯低劑量組）、E組（健骨伸筋湯高劑量組）。

1.2.2 造模方法通過改良的Hulth法［2］（取背側(cè)切口切除雙側(cè)卵巢，再按照Hulth法：將大鼠麻醉后，仰臥于手術(shù)臺(tái)上，無菌條件下取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長(zhǎng)約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，然后切斷前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨面。）制成腎虛型大鼠的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)畢無菌敷料包扎，不固定傷肢。術(shù)后每天每只大鼠肌肉注射青霉素20萬U，共1 w。術(shù)后每天強(qiáng)迫大鼠活動(dòng)30 min。2周后隨機(jī)處死造模成功的1只大鼠，切取雙側(cè)股骨髁軟骨處理后，電鏡下觀察，證實(shí)造模成功，而后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 給藥方法及病理標(biāo)本選取建立大鼠的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，2 w后，開始對(duì)空白對(duì)照組、模型組生理鹽水灌胃；治療組分低、高濃度進(jìn)行中藥灌胃（中藥方劑：骨碎補(bǔ)、鹿銜草、丹參、牛膝、薏苡仁、五加皮、穿山龍）。對(duì)照組：壯骨關(guān)節(jié)丸；大鼠劑量（mg/ kg）=系數(shù)（6.25）×人的劑量（mg/kg）。

于灌胃后第7周、13周各組隨機(jī)挑選一半，取大鼠關(guān)節(jié)滑液0.3-1 mL，用凍存管-4℃普通冰箱，取材結(jié)束后將所有采集的滑液標(biāo)本置于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?，?biāo)本于1周內(nèi)進(jìn)行IL-1β、NO含量的測(cè)定。對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行大體觀察，然后用空氣栓塞法處死行大體解剖學(xué)觀察，并用10倍手術(shù)顯微鏡觀察軟骨表面，參照關(guān)節(jié)鏡對(duì)OA的分度方法，對(duì)軟骨表面情況進(jìn)行分級(jí)。

用線鋸將股骨髁完整取下，清除軟組織，用生理鹽水蕩洗2遍，置入10%的中性緩沖福爾馬林中固定48h后，在室溫下用10%的EDTA脫鈣液脫鈣15天左右，將所有標(biāo)本石蠟包埋并切片，分別行HE、S/F染色，參照改良Mankin法進(jìn)行評(píng)分［3］。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

大體標(biāo)本觀察：按軟骨損傷分級(jí)法將軟骨退變程度分為：0級(jí)正常；Ⅰ級(jí)關(guān)節(jié)軟骨變?yōu)辄S白色，光澤差，表面仍較平滑；Ⅱ級(jí)在Ⅰ級(jí)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)潰瘍改變，潰瘍未及全層；Ⅲ級(jí)軟骨全層破壞，軟骨下骨暴露。模型組（B）關(guān)節(jié)磨損程度遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組（A），表明造模成功，經(jīng)過治療壯骨關(guān)節(jié)丸組（C）、低劑量組（D）、高劑量組（E）關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)均有所改善，優(yōu)于模型組，見表1。

表1 各組軟骨組織損傷分級(jí)

光學(xué)顯微鏡（OM）觀察：將取出的股骨髁軟骨標(biāo)本行常規(guī)固定，脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡（OM）下觀察。依據(jù)改良Mankin法中的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞以及潮線的完整性進(jìn)行OA評(píng)分，見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)切片Mankin評(píng)分比較（x±s）

以上表明，造模后大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨評(píng)分遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，軟骨破壞嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)治療后，評(píng)分均有所降低，說明治療對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨有修復(fù)作用，健骨伸筋湯低劑量組、高劑量組與壯骨關(guān)節(jié)丸組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

IL-1β、NO含量的測(cè)定，見表3，表4。

表3 IL-1β的PU值比較（x±s）

以上表明：模型組IL-1β的PU值較空白對(duì)照組高（P＜0.01），壯骨關(guān)節(jié)丸組較模型組降低，但較低劑量、高劑量組高（P＜0.01）。結(jié)果提示在降低軟骨IL-1β表達(dá)上高劑量組效果最明顯，低劑量組次之，均優(yōu)于對(duì)照組（壯骨關(guān)節(jié)組）。

表4 各組大鼠血清中NO的含量測(cè)定對(duì)比（x±s）

以上表明：模型組與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清中NO含量顯著升高（P＜0.01）。低劑量組、高劑量組與模型對(duì)照組比較，NO含量顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果提示在降低軟骨NO含量表達(dá)上高劑量組效果最明顯，低劑量組次之，均優(yōu)于對(duì)照組（壯骨關(guān)節(jié)組）。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹癥”范疇，多以肝腎不足為本，氣滯血瘀為標(biāo)。健骨伸筋湯選用補(bǔ)腎壯骨、活血化瘀的中藥組方而成，健骨伸筋湯（鹿銜草、骨碎補(bǔ)、丹參、牛膝、薏苡仁、五加皮、穿山龍）的臨床療效已有觀察，方中鹿銜草味甘、苦、性溫，入肝、腎二經(jīng)，補(bǔ)虛益腎，祛風(fēng)除濕。骨碎補(bǔ)，味苦，性溫，歸肝腎經(jīng)，補(bǔ)腎、活血、止血、續(xù)傷。方中丹參、牛膝為臣，二藥均為活血化瘀見長(zhǎng)合而用之，相得益彰，共湊活血通絡(luò)之效。穿山龍、薏苡仁、五加皮三藥為佐，共助君藥祛風(fēng)除濕蠲痹之力，兼以柔筋之效。諸藥合用，益腎壯骨以扶正，祛濕活絡(luò)以祛邪，標(biāo)本同治。本實(shí)驗(yàn)表明健骨伸筋湯可降低IL-1β和NO含量，提示其療效機(jī)理可能在于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的異?；顒?dòng)，從而促進(jìn)損傷關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)［4-5］。健骨伸筋湯在低、高劑量均有一定的關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用，可一定程度地延緩膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型軟骨的退變。

綜上所述，說明健骨伸筋湯能夠促進(jìn)軟骨修復(fù)，并顯著降低了IL-1β的表達(dá)。證實(shí)了健骨伸筋湯作用持久，副作用小，也提示骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷可能與IL-1β異常高表達(dá)有關(guān)，防治作用可能是通過抑制IL-1β的分泌而實(shí)現(xiàn)的，這與前人研究結(jié)論一致［6］。同時(shí)，健骨伸筋湯提高機(jī)體抗氧化能力，改善局部微循環(huán)，促進(jìn)炎性物質(zhì)的吸收，清除過多的超氧自由基從而避免超氧自由基及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損傷，抑制炎癥因子NO的過量釋放［7］，從而保護(hù)了軟骨細(xì)胞，延緩了關(guān)節(jié)軟骨退變的進(jìn)展。但治療最佳作用的用量是多少，對(duì)骨細(xì)胞如何調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。

［1］齊偉，郝東明.健骨伸筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床觀察［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，19（2）:25.

［2］于娟，李莎莎，葉瑩儀，等.補(bǔ)腎活血方對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（6）:171-174.

［3］周軍，劉曉海，宋亞玲，等.抗骨增生膠囊對(duì)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（19）:145.

［4］錢春美，袁秀榮，文小平，等.芍藥舒筋片對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨病理及COMP水平的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2013，47（3）：76-78.

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Effects of Jiangu Shenjin Decoction on Changes of the Cartilage and IL-1Β，NO of Knee Osteoarthritis of Rats

LIU Hongbo1，JING Chunying＊1，XIE Yiqiang2，HAN Ping3
（1 TCM College，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；2 Scientific Research Office，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；3 Deparment of TCM，Affiliated Hospital of Hainan Medical University，Haikou 570102，China）

Objective To explore the effects of Jiangu Shenjin decoction in changes of the cartilage and IL-1β，NO of knee osteoarthritis of rats.Methods:KOA experimental animal mode was applied in this experiment，45 female SD rats were randomly divided into 5 groups，9 rats in each group.Rats were got knee osteoarthritis by hulth.Two weeks later，the nomal group and model group were fed Physiological saline.The treatment groups of low concentration Jiangu Shenjin decoction and high concentration Jiangu Shenjin decoction were fed low or high concentration Jiangu Shenjin decoction.Observing the changes of the cartilage and IL-1β，NO of knee osteoarthritis of rats in seven week and thirteen week.Results The changes of the cartilage of the rats by hulth was worse obvious than that of the normal rats，the difference was statistically significant（P＜0.05）.After treatment，the changes of the cartilage and IL-1β，NO were improved.It proved that cartilage of osteoarthritis rats was repaired.Groups of low concentration Jiangu Shenjin decoction and high concentration Jiangu Shenjin decoction were better than those of the the matched group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Jiangu Shenjin decoction can decrease the content of the IL-1β，NO，and protect cartilage of knees and put off the degeneration of cartilage.

Jiangu Shenjin decoction；knee osteoarthritis；cartilage repair

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.09.065

1672-2779（2015）-09-0129-03

：蘇玲本文校對(duì)：馮志成

2015-04-09）

海南省教育廳科研項(xiàng)目（No：Hjkj2011-29）

*通訊作者：jcy_ok@126.com