蠲痹顆粒對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響※

方春鳳 吳 洋 李兆福 劉 濤 劉維超 狄朋桃*

（1云南省中醫(yī)醫(yī)院兒科，昆明650021；2云南省中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科，昆明650021；3云南中醫(yī)學(xué)院科技處，昆明650500；4云南省中醫(yī)醫(yī)院病理科，昆明650021）

蠲痹顆粒對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響※

方春鳳1吳 洋2李兆福3劉 濤4劉維超2狄朋桃2*

（1云南省中醫(yī)醫(yī)院兒科，昆明650021；2云南省中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科，昆明650021；3云南中醫(yī)學(xué)院科技處，昆明650500；4云南省中醫(yī)醫(yī)院病理科，昆明650021）

目的探討蠲痹顆粒對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨軟骨細(xì)胞凋亡的影響，揭示其治療骨關(guān)節(jié)炎（OA）的部分作用機(jī)制，為蠲痹顆粒方治療OA提供理論依據(jù)。方法將42只新西蘭兔采用改良Hulth法建立兔膝OA模型，造模后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、蠲痹顆粒組及陽(yáng)性藥（雙醋瑞因）組。藥物干預(yù)或灌生理鹽水6周后，取出關(guān)節(jié)軟骨，石蠟切片HE染色觀察軟骨組織鏡下病理形態(tài)改變，免疫組化法檢測(cè)軟骨組織caspase-3表達(dá)水平，TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果蠲痹顆粒組和陽(yáng)性藥對(duì)照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織caspase-3蛋白的表達(dá)、軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論蠲痹顆粒能下調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，抑制膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，可能是蠲痹顆粒治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。

蠲痹顆粒；膝骨關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞凋亡；caspase-3；中成藥療法；痹證

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種關(guān)節(jié)退行性病變，指與遺傳、創(chuàng)傷、內(nèi)分泌、肥胖、年齡等多種因素相關(guān)的關(guān)節(jié)軟骨降解，并伴有軟骨皸裂、潰瘍、脫失的關(guān)節(jié)疾病，主要發(fā)生于老年人，75歲以上人群80%患有OA［1］，是最常見(jiàn)老年病。其發(fā)病與人體于中老年以后，中氣不足，氣血失和，肝腎漸虧，營(yíng)衛(wèi)不和，或衛(wèi)陽(yáng)虧虛，感受風(fēng)寒濕邪外侵，閉阻經(jīng)脈有關(guān)，治療以溫陽(yáng)、祛風(fēng)、滲濕的藥物為主。

蠲痹顆粒為全國(guó)第二批名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師、云南省名老中醫(yī)吳生元教授在繼承著名中醫(yī)學(xué)家吳佩衡學(xué)術(shù)思想及臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上研究、總結(jié)而成，全方主要由附片、桂枝、麻黃、細(xì)辛、川芎、赤芍、羌活、黃芪等10余味藥物組成，具有溫陽(yáng)通絡(luò)、祛風(fēng)散寒除濕之功，臨床應(yīng)用多年，療效顯著。故在蠲痹顆粒治療骨關(guān)節(jié)炎取得良好療效的基礎(chǔ)上，從調(diào)控caspase-3蛋白表達(dá)水平及對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡影響的角度，闡明其防治膝OA發(fā)生發(fā)展的部分作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物健康新西蘭兔42只，6月齡，體重1.5～2.5 kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）2011-0004。

1.2 藥品蠲痹顆粒：規(guī)格15 g/袋（云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，滇藥制字〈Z〉20082554A）；雙醋瑞因膠囊：規(guī)格50 mg/粒，（昆明積大制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20100150）。

1.3 試劑和儀器原位凋亡檢測(cè)試劑盒（ROCHE公司），caspase-3抗體（ENZO公司）。DS-Fi2顯微鏡、石蠟切片機(jī)、BM-Ⅷ生物組織包埋機(jī)、CS-VI型攤片烤片機(jī)、自動(dòng)脫水機(jī)、冷凍臺(tái)。

2 方法

2.1 兔膝OA模型制造蠲痹顆粒組、陽(yáng)性藥（雙醋瑞因）組、KOA模型組均以改良Hulth法復(fù)制右膝OA模型。具體方法：丙戊酸鈉注射液（0.8～1.0 ml/kg）麻醉，將兔仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，右膝關(guān)節(jié)局部脫毛、消毒，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長(zhǎng)約2 cm，逐層切開(kāi)或鈍性分離，找到內(nèi)側(cè)半月板后切除，顯露前交叉韌帶后切斷，手術(shù)時(shí)避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面，行抽屜試驗(yàn)陽(yáng)性后縫合術(shù)口，麻醉蘇醒后放回兔籠，使動(dòng)物自由活動(dòng)。術(shù)后1周內(nèi)每天肌肉注射青霉素鈉20萬(wàn)u，每天追趕動(dòng)物活動(dòng)30分鐘。4周后開(kāi)始治療。假手術(shù)組切開(kāi)關(guān)節(jié)囊后縫合，不破壞關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)。

2.2 分組42只新西蘭兔隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）模型組各10只，蠲痹顆粒組、陽(yáng)性藥（雙醋瑞因）組各11只。每組動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2.3 給藥術(shù)后4周開(kāi)始給藥，將藥物蠲痹顆粒及雙醋瑞因按兔與人用藥量以Meeh Rubner公式換算等效劑量。假手術(shù)組、KOA模型組以生理鹽水10mL灌胃，蠲痹顆粒組以5.4 g/（kg·d）（生藥6.16 g/（kg· d））的水溶液10 ml灌胃，陽(yáng)性藥（雙醋瑞因）組予雙醋瑞因4.5 mg/（kg·d）溶于同體積蒸餾水，每日1次，給藥6周。

2.4 標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)第10周后，注入空氣法處死大白兔，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)、色澤變化，取下右膝內(nèi)側(cè)脛骨軟骨組織，放入10%磷酸緩沖福爾馬林中固定。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 HE染色固定48小時(shí)后，流水沖洗，放入10% EDTA中脫鈣，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，浸蠟，包埋，切片，HE染色，封片，顯微鏡下觀察。

2.5.2 免疫組化法檢測(cè)軟骨組織caspase-3蛋白表達(dá)水平切片脫蠟至水，PBS沖洗3次，3%H2O2室溫孵育10min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉，滴加一抗（抗caspase-3）工作液，4℃孵化過(guò)夜，PBS沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，滴加DAB顯色，蒸餾水終止顯色反應(yīng)，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞20 s、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

2.5.3 TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡切片脫蠟至水，浸入蛋白酶K工作液15 min，配制TUNEL反應(yīng)混合液，PBS液沖洗2次，滴加50 μlTUNEL反應(yīng)液，加蓋，37℃下閉光和加濕反應(yīng)60 min，PBS漂洗玻片3次，滴加POD轉(zhuǎn)換液，PBS漂洗玻片3次，滴加DAB底物，PBS漂洗玻片，顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用方差齊性檢驗(yàn)后單因素方差分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以（x±s）表示，以P＜0.05為顯著水平。

3 結(jié)果

3.1 HE染色軟骨組織鏡下觀察見(jiàn)圖1。

3.1.1 假手術(shù)組關(guān)節(jié)透明軟骨細(xì)胞分布均勻，排序整齊，各層細(xì)胞層次清晰，細(xì)胞飽滿(mǎn)，細(xì)胞核圓潤(rùn)，底層（生發(fā)層）細(xì)胞較表層和中層細(xì)胞稍大，核漿比大，潮線(xiàn)完整。

3.1.2 模型組關(guān)節(jié)透明軟骨表面結(jié)締組織增厚，表層和中層軟骨細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮變形，中層軟骨細(xì)胞柱狀排列消失，底層細(xì)胞與假手術(shù)組無(wú)明顯差異，潮線(xiàn)欠完整。

3.1.3 蠲痹顆粒組中層和底層軟骨細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，排列不規(guī)則，細(xì)胞變飽滿(mǎn)，細(xì)胞核圓潤(rùn)，底層細(xì)胞核漿比大，潮線(xiàn)完整。

3.1.4 陽(yáng)性藥組中層和底層軟骨細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，排列不規(guī)則，細(xì)胞變飽滿(mǎn)，細(xì)胞核圓潤(rùn)，底層細(xì)胞核漿比大，潮線(xiàn)完整。

圖1 各組HE染色軟骨組織鏡下觀察

3.2 蠲痹顆粒對(duì)兔KOA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞caspase-3表達(dá)結(jié)果切片中細(xì)胞胞漿呈棕色顆粒為caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，即caspase-3表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，以caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例表示caspase-3陽(yáng)性率。陽(yáng)性率（%）=caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。見(jiàn)表1。

表1 蠲痹顆粒對(duì)兔KOA模型caspase-3表達(dá)水平的影響（x±s）

3.3 蠲痹顆粒對(duì)兔KOA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響切片中凋亡細(xì)胞核呈棕黃色顆粒，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例表示細(xì)胞凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。見(jiàn)表2、圖2。

表2 蠲痹顆粒對(duì)兔KOA模型軟骨細(xì)胞凋亡水平的影響（x±s）

圖2 各組治療后切片細(xì)胞凋亡組織鏡下觀察

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞、骨質(zhì)增生為病理特征的慢性、進(jìn)行性關(guān)節(jié)病變，病因病機(jī)尚不清楚，研究表明軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的降解和軟骨下骨的再造是導(dǎo)致OA軟骨降解的主要原因［2］，而軟骨細(xì)胞凋亡在OA發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［3］。正常情況下，軟骨細(xì)胞凋亡是一個(gè)正常的現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞的凋亡對(duì)于軟骨的成熟和形態(tài)維持有著重要的作用，一旦軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)度，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，引起細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，從而導(dǎo)致OA的發(fā)生。在軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase家族起著非常重要的作用，因caspase-3在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中占據(jù)中樞位置，其活化與否決定了凋亡程序啟動(dòng)［4-5］，活化的caspase-3降解細(xì)胞內(nèi)底物骨架蛋白、核蛋白、MEK激酶、PKA2等，通過(guò)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)途徑介導(dǎo)使細(xì)胞發(fā)生凋亡［6］。

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，《素問(wèn)·痹論》：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹，其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹……病在陰者命曰痹”，骨關(guān)節(jié)炎主要好發(fā)于老年人，正如《素問(wèn)·上古天真論》所云“丈夫……，五八，腎氣衰……；六八，陽(yáng)氣衰竭于上……；七八，肝氣衰，筋不能動(dòng)……?！辈饺肜夏旰螅梭w機(jī)能減退，則肝腎不足、陽(yáng)氣漸衰，陽(yáng)氣失去維持正常的溫煦生理功能，不能固密衛(wèi)外，風(fēng)寒濕相夾雜，侵襲機(jī)體，犯于經(jīng)絡(luò)、筋骨，邪氣壅塞而成痹，陽(yáng)氣虧虛為發(fā)病的內(nèi)在病理基礎(chǔ)，故“陽(yáng)虛外感風(fēng)寒濕邪”是OA發(fā)生的關(guān)鍵病機(jī)所在。

蠲痹顆粒以附子辛苦大溫、大熱，通行十二經(jīng)，具有溫散寒濕、補(bǔ)火助陽(yáng)之功為君藥，吳佩衡《醫(yī)藥簡(jiǎn)述》：“附子溫暖水寒，補(bǔ)命門(mén)真火，回陽(yáng)生津，驅(qū)逐陰寒，回陽(yáng)救逆”；桂枝、麻黃、細(xì)辛等辛溫藥物，功擅“祛風(fēng)散寒、溫經(jīng)通陽(yáng)”，黃芪益氣固表，增強(qiáng)衛(wèi)陽(yáng)之衛(wèi)外功能，川芎、赤芍活血通絡(luò)、散瘀止痛，使閉阻邪氣外出，經(jīng)絡(luò)通暢；配伍羌活、獨(dú)活、海風(fēng)藤、透骨草等祛風(fēng)濕，全方藥物配伍，共奏“溫陽(yáng)散寒、祛風(fēng)除濕”之功。部分研究還顯示黃芪能降低細(xì)胞凋亡率和Bim蛋白的表達(dá)，抵抗H2O2造成的體外軟骨細(xì)胞損傷［7］，川芎可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌合成代謝因子，刺激細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)合成［8］。附子、獨(dú)活、細(xì)辛有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，蠲痹顆粒能下調(diào)caspase-3表達(dá)，阻滯凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低軟骨細(xì)胞凋亡率，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡。這可能是蠲痹顆粒延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，從而介導(dǎo)其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用的有效機(jī)制。參考文獻(xiàn)

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The Influence of Juanbi Granule on Chondrocyte Apoptosis of Rabbit Knee Osteoarthritis

FANGChunfeng1，WU Yang2，LI Zhaofu3，LIU Tao4，LIU Weichao2，DI Pengtao2△
（1.Department of Pediatrics，Yunnan Provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China；2.Department of Rheumatology，Yunnan provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China；3.Department of Science and Technology，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming650500，China；4.Department of Pathology，Yunnan Provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China）

Objective To explore the influence of Juanbi granule on chondrocyte apoptosis of rabbit knee osteoarthritis，reveal partial treat mechanism of the osteoarthritis（OA），and provide the theory basis for treatment of OA.Methods 42 NewZeal and rabbits were used to establish improved Hulth model of knee OA.After the mould，the rabbits were randomly divided into control group，model group，Juanbi granule group and the positive drug group（double vinegar）.After six weeks intervention of drugs or physiological saline，the articular cartilage was removed.We observed the pathological morphological changes of HE dyeing cartilage tissue under the mirror，detected the caspase-3 expression level in chondrocytes by immunohistochemical method，and detected chondrocytes apoptosis by TUNEL method. Rusults The rabbit knee joint cartilage caspase-3 protein expression level and cartilage cell apoptosis rate of Juanbi granule group and positive medicine control group were significantly lower than those of the model group，and there was statistical significance（P＜0.05）. Conclusion Juanbi granule can cut the caspase-3 protein expression and cell apoptosis.This may be one of the mechanisms of Juanbi granule in treating osteoarthritis.

Juanbi granule；knee osteoarthritis；apoptosis；caspase-3；therapy of traditional Chinese medicine patent prescription；arthralgia syndrome

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.14.070

1672-2779（2015）-14-0136-03

：楊杰本文校對(duì)：湯小虎

2015-06-11）

國(guó)家中醫(yī)藥管理局云南吳佩衡扶陽(yáng)學(xué)術(shù)流派工作室項(xiàng)目；云南省自然基金項(xiàng)目（No：2011FZ260）

*通訊作者：dipengtao88@126.com