羊棘球蚴（包蟲）基因工程亞單位疫苗免疫母羊后羔羊母源抗體消長規(guī)律研究

范才良，廖天學(xué)，李 慧，榮 超，李陽春（.重慶市榮昌區(qū)畜牧獸醫(yī)局，榮昌 40460；.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系；.重慶澳龍生物制品有限公司）

羊棘球蚴（包蟲）基因工程亞單位疫苗免疫母羊后羔羊母源抗體消長規(guī)律研究

范才良1，廖天學(xué)1，李 慧2，榮 超3，李陽春3
（1.重慶市榮昌區(qū)畜牧獸醫(yī)局，榮昌 402460；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系；3.重慶澳龍生物制品有限公司）

通過對懷孕4周的母羊進(jìn)行羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗的首免，在懷孕8周時(shí)進(jìn)行二免，待母羊分娩后，分別在羔羊1、3、5、8、12、17周齡采集血清，用ELISA方法檢測棘球蚴母源抗體，監(jiān)測抗體消長規(guī)律。結(jié)果顯示：羔羊血清中母源抗體第1周最高，平均抗體OD450值0.900，第3周時(shí)為0.710，17周時(shí)抗體保護(hù)處于臨界值；其陽性率在1~5周為100％，第17周時(shí)僅30％，從而選擇羔羊最佳首免時(shí)間為12～16周。

羊包蟲?。灰呙?；母源抗體；檢測

棘球蚴病又稱包蟲病，是人和動物感染細(xì)粒棘球絳蟲及多房棘球絳蟲的幼蟲所致的疾病。細(xì)粒棘球絳蟲主要寄生在犬、狼、狐貍等野生動物的小腸內(nèi)，蟲卵經(jīng)過糞便排出，人和動物誤食了被蟲卵污染的食物、水、草、飼料等進(jìn)入體內(nèi)發(fā)育成六鉤蚴，在小腸鉆過腸壁進(jìn)入血液循環(huán)，在人和動物的肝、肺及其他器官內(nèi)形成包囊［1］，可在動物體內(nèi)終生寄生。終末宿主如犬、狼、狐貍等采食了含有包蟲的動物或者臟器，包囊中的原頭蚴粘附寄生在小腸壁發(fā)育為成蟲。包蟲病是嚴(yán)重危害人體健康和生命安全、影響畜牧業(yè)健康發(fā)展的重大動物寄生蟲病之一。世界動物衛(wèi)生組織將其列為B類動物疾病，我國將其列為二類動物疫病和人獸共患病。包蟲病呈全球性分布，發(fā)展中國家流行最高。中亞是包蟲病流行最嚴(yán)重的地區(qū)，中東、東亞、西亞、歐洲、南美洲、大洋洲以及非洲北部、東部和南部的一些國家和地區(qū)都有包蟲病的分布［2］。我國是包蟲病高發(fā)區(qū)，主要終末宿主是犬，人及牛、羊等11種家畜為中間宿主，其中綿羊感染最為嚴(yán)重。包蟲病流行區(qū)人群平均患病率1.08％，主要分布在內(nèi)蒙古、四川、西藏、甘肅、青海、寧夏、新疆等7個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）的牧區(qū)和半牧區(qū)［3］，受威脅人口為6 600萬。在我國大多數(shù)牧區(qū)，羊是主要感染發(fā)病的動物，控制包蟲的關(guān)健是免疫中間宿主，切斷傳播途經(jīng)［4］。

為了克服“月月驅(qū)蟲”的弊端，焦偉等［5］用吡喹酮緩釋劑型埋植在犬皮下，使藥物在體內(nèi)緩慢釋放，達(dá)到長期驅(qū)蟲的作用。根據(jù)我國情況，為徹底控制包蟲病，應(yīng)采取以免疫預(yù)防為主的防治措施。近年來，大量學(xué)者在研制細(xì)粒棘球絳蟲疫苗方面做了大量工作，均取得了一定進(jìn)展。其中，最為成功的包蟲病疫苗為EG95疫苗［6-7］，有EG95基因工程亞單位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗、重組酵母疫苗等EG95疫苗。本試驗(yàn)采用羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗二次免疫懷孕母羊，羔羊出生后第1、3、5、8、12、17周采集血清，研究其母源抗體變化規(guī)律，為確定羔羊最佳首免日期提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 疫苗與試劑

羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗（重慶澳龍生物制品有限公司，生產(chǎn)批號：20140201）；羊棘球蚴（包蟲）病ELISA抗體檢測試劑盒（重慶澳龍生物制品有限公司，生產(chǎn)批號：20150402）。

1.2 試驗(yàn)動物

在重慶路孔、吳家兩地選擇3家養(yǎng)殖戶中棘球蚴檢測抗體呈陰性的懷孕4周左右的健康母羊6只、初生羔羊10只作為試驗(yàn)動物。

1.3 主要儀器

LDZX-40B1高壓滅菌鍋（中國上海）；PhysioCare多導(dǎo)移液器（Eppendorf公司）；Concept移液器（Eppendorf公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（熱電（上海）儀器有限公司）；XK96-A/B快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 免疫方法 6只母羊懷孕4周時(shí)，每只羊注射羊包蟲病疫苗1mL（1頭份），間隔4周后進(jìn)行二免，具體免疫程序見表1。

表1 試驗(yàn)?zāi)秆蛎庖叱绦?/p>

1.4.2 血清抗體檢測 待母羊分娩后，分別在10只初生羔羊第1、3、5、8、12、17周齡進(jìn)行頸靜脈采血，分離血清，參照羊棘球蚴（包蟲）病ELISA抗體檢測試劑盒操作方法進(jìn)行棘球蚴抗體檢測。

1.4.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)滿足下列條件，方為有效：標(biāo)準(zhǔn)陽性對照孔平均OD450≥0.6±0.02；標(biāo)準(zhǔn)陰性對照孔平均OD450≤0.3±0.02。羔羊母源抗體水平判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品OD450≤0.3，判為細(xì)粒棘球蚴（包蟲）抗體陰性；樣品OD450＞0.3，判為細(xì)粒棘球蚴（包蟲）抗體陽性。

2 結(jié)果

2.1 羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體水平檢測結(jié)果

羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體水平檢測結(jié)果見表1～3，其抗體水平消長規(guī)律見圖1和圖2。結(jié)果顯示，羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體水平第1周最高，平均抗體OD450值為0.900，第3周時(shí)為0.710，第5周降至0.602，至17周時(shí)抗體保護(hù)處于臨界值。試驗(yàn)Ⅰ組效果優(yōu)于試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組。

表2 各日齡羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體水平檢測結(jié)果

表3 各日齡羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體水平檢測結(jié)果

表4 各日齡羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體水平檢測結(jié)果

圖1 各組羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體水平消長規(guī)律

圖2 羔羊細(xì)粒棘球蚴平均母源抗體水平消長規(guī)律

2.2 羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體陽性率與年齡的相關(guān)性

由圖3可見，羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體陽性率在1～5周為100％，第8周時(shí)出現(xiàn)陰性結(jié)果，第17周時(shí)僅30％，至17周都有羊棘球蚴病基因亞單位疫苗免疫力，因?yàn)槟冈纯贵w的高低與懷孕母羊的身體狀況、飼養(yǎng)管理、初生羔羊獲得初乳的能力有關(guān)。經(jīng)過免疫包蟲疫苗的母羊所產(chǎn)新生羔羊包蟲疫苗最佳首免時(shí)間應(yīng)在出生后12～16周。

圖3 羔羊細(xì)粒棘球蚴母源抗體陽性率與年齡的相關(guān)性

3 討論

（1）母源抗體是新生動物通過母體胎盤、初乳或卵黃等途徑從母體所獲得的特異性抗體。獲得母源抗體的新生動物在出生后數(shù)天或者相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)得到保護(hù)，使之免受某些病原體的感染。哺乳動物的初乳中含有大量抗體，幼齡動物攝入初乳后，能立即獲得母源抗體，提高幼齡動物的抵抗力，抑制條件性病原菌的條件性紊亂。初乳中抗體的含量12h后迅速下降，幼齡動物腸道粘膜吸收抗體的能力也隨著時(shí)間的推移而逐漸減退，24h后已經(jīng)達(dá)到幾乎不能吸收的狀態(tài)。所以保證幼齡動物出生后24h內(nèi)攝入初乳，是保證幼齡動物成活率的關(guān)鍵。

（2）EG95基因工程疫苗是一種免疫球蛋白，屬于異源蛋白，Quil A是一種皂素純化物，有一定的毒性，進(jìn)入體內(nèi)可能引起溶血現(xiàn)象，通過皮下注射進(jìn)入機(jī)體后，由于有機(jī)體的排他性，可能會引起被免動物體溫升高、精神沉郁、減食等，屬于正?，F(xiàn)象，一般情況下24～36h動物體溫恢復(fù)正常，免疫期間加強(qiáng)飼養(yǎng)管理非常重要，不會出現(xiàn)動物因接種該疫苗而發(fā)生該病和死亡現(xiàn)象［8］。

（3）包蟲病是由棘球絳蟲的幼蟲寄生于人或動物體內(nèi)引起的人獸共患寄生蟲病，人患包蟲病主要表現(xiàn)以慢性消耗為主，體質(zhì)日漸衰弱，影響生活質(zhì)量，降低甚至喪失勞動能力，嚴(yán)重者會危及生命。包蟲寄生于羊、牛、馬等動物肝、肺及其他器官內(nèi)，影響動物生長發(fā)育、降低生產(chǎn)性能、延長飼養(yǎng)周期、危害食品衛(wèi)生安全、污染水源及環(huán)境、阻礙畜牧業(yè)發(fā)展［9］。

（4）防控包蟲病方法很多，一是控制終末宿主犬、狼、狐貍等野生動物，定期或者不定期給家犬驅(qū)蟲，或在狼、狐貍等野生動物出沒地區(qū)不定期投放驅(qū)蟲藥物；二是控制中間宿主，羊具有采食低洼牧草的特點(diǎn)，最易感染包蟲病，對羊等中間宿主免疫接種疫苗非常重要［10］；三是該病為人獸共患病，應(yīng)對相關(guān)人群加強(qiáng)健康教育，養(yǎng)成良好的生活衛(wèi)生習(xí)慣，發(fā)現(xiàn)病人及時(shí)救治，提供安全飲水等。

［1］陳開華，楊伯全，邱加閩，等.四川阿壩牧區(qū)包蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告［J］.地方病通報(bào)，1996，11（2）：81-82.

［2］Chai J J.Epidemiological studies on cystic echinococcosis in China a review［J］.Biomed Environ Sci，1995，8（2）：122-136.

［3］陳開華，楊伯全，邱加閩，等.四川阿壩牧區(qū)包蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告［J］.地方病通報(bào)，1996，11（2）：81-82.

［4］Lightowlers MW，Lawrence S B，Gauci C C，et al.Vaccines againsthydatidosis usinga defined recombinant vaccine antigen［J］.Parasite Immunol，1996 18（9）：457-462.

［5］焦偉，柴君杰，伊斯拉音·烏斯曼，等.犬用吡喹酮緩釋劑控制家犬細(xì)粒棘球絳蟲自然感染的現(xiàn)場初步觀察［J］.地方病通報(bào)，1998，13（2）：43-44.

［6］鐘秀琴，楊光友.細(xì)粒棘球絳蟲EG95疫苗的研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45（8）：1207-1212.

［7］賈紅，劉丹，侯紹華，等.羊細(xì)粒棘球蟲蚴病抗體間接ELISA檢測方法的建立［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（1）：65-70.

［8］Frederick R.Improving vaccine performance with adjuvants［J］.Clin Infect Dis，2000，30（s3）：266-227.

［9］齊普生.棘球蚴在我國流行及防治［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，（增刊）：95.

［10］朱勇，柳建發(fā).棘球蚴病的免疫學(xué)診斷研究進(jìn)展［J］.地方通報(bào)，2007，22（5）：116-118.

Dynamic of Maternal Antibody Immunized with Genetic Engineering Subunit Vaccine of Sheep Hydatid Disease

Fan Cailiang1，LiaoTianxue1，Li Hui2，et al
（1.Animal Husbandryand VeterinaryBureau ofRongchangDistrict，Chongqing402460，China；2.Department ofVeterinaryMedicine，RongchangCampus ofSouthwest University，Chongqing 402460，China）

Hydatid disease caused byechinococci larval parasites，is a zoonotic parasitic disease，which endangers people's health and safety，and affects the healthy development of animal husbandry.Hydatid disease was listed as class B animal diseases by Office International des Epizooties（OIE）.In the experiment，4 week pregnant ewes were immunized with genetic engineering subunit vaccine of sheep hydatid disease，and the pregnant ewes were secondarily immunized with the same vaccine 4 weeks later.The maternal antibodies oflambs fromimmunized ewes were detected at the age of1，3，5，8，12，17 weeks byenzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The results showed that，the highest antibodytiters with average OD450=0.900，were detected at the lst week，the OD450of the 3rd week was 0.710，and the antibody protection threshold was found at the 17th week.The antibody positive rate was 100％during1～5 week，and reduced to30％at the 17th week.The best first immunization time should be during 12～16 weeks.

sheep hydatid；vaccine；maternal antibody；detection

S858.26

A

2095-3887（2015）05-0053-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.05.015

2015-07-01

范才良（1967-），男，高級獸醫(yī)師。