不同雜交組合肉羊肌肉組織中MyoD基因mRNA表達的研究

項露頡，孫麗敏，趙 佳，白 曼，阮紅玲，姜懷志（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118）

遺傳育種

不同雜交組合肉羊肌肉組織中MyoD基因mRNA表達的研究

項露頡，孫麗敏，趙 佳，白 曼，阮紅玲，姜懷志
（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118）

生肌決定因子（MyoD）是脊椎動物胚胎期肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一。為了研究MyoD基因mRNA在不同雜交品種肉羊之間的表達差異，試驗選取杜泊羊與東北細毛羊雜交（杜東組），小尾寒羊與東北細毛羊雜交（小東組）的兩組雜交品種羊各3只，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測MyoD基因的表達量。結(jié)果表明：MyoD在各組羊胸肌、后腿肌、背最長肌中均有表達，且在不同雜交組合的同一肌肉組織中表達量差異顯著（P＜0.05）；MyoD基因在杜東組中胸肌的相對表達量為小東組的1.96倍，杜東組中的后腿肌相對表達量為小東組的6.30倍，杜東組中背最長肌的相對表達量為小東組的1.48倍。

肉羊；MyoD；基因表達

隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善，羊肉以其獨特的營養(yǎng)價值和風(fēng)味倍受人們的青睞，進而促進了肉羊產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展。國外肉羊業(yè)發(fā)展的經(jīng)驗表明，利用品種間的雜種優(yōu)勢，采用經(jīng)濟雜交方式是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羊肉最為有效的方法之一。肉羊的主要經(jīng)濟性狀是產(chǎn)肉性狀和肉質(zhì)性狀，而這二者是與其肌纖維數(shù)量和生長密切相關(guān)的［1］，MoyD（myogenicdiffercntiation 1）基因是正向調(diào)節(jié)骨骼肌細胞分化和生長的生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFS）成員之一，與成肌細胞增殖和肌肉增生有關(guān)，能促使多種肌細胞的增殖，并調(diào)節(jié)單核的成肌細胞分化為多核的肌纖維［2］。國內(nèi)在豬［3-4］、肉牛［5］、山羊［6］等動物的相關(guān)研究表明，MoyD基因與動物的產(chǎn)肉性狀和肉質(zhì)性狀具有極其密切的相關(guān)性，可以作為動物產(chǎn)肉性狀及肉質(zhì)性狀的遺傳標記。

自上個世紀90年代末期以來，我國肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但由于缺乏專門化的肉用綿羊品種，各地紛紛利用引進的國外優(yōu)質(zhì)肉羊品種與本地綿羊品種進行二元或三元雜交來發(fā)展當?shù)氐娜庋虍a(chǎn)業(yè)，建立了多種不同的雜交組合模式。吉林省西部農(nóng)牧交錯區(qū)近20年來，先后引進多個國外肉用綿羊良種，但由于種羊群體規(guī)模較小，廣大農(nóng)戶仍以小尾寒羊與當?shù)丶毭虻碾s種作為發(fā)展肉羊的主要模式。因此，為了比較不同父本品種與當?shù)匮虻碾s交效果，本研究開展了對不同父本來源的雜交組合羊主要產(chǎn)肉部位肌肉中MoyD基因表達水平的檢測，為篩選和優(yōu)化肉羊雜交組合提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年春季于吉林省乾安志華種羊繁育公司的商品肉羊群中，分別在杜泊羊（）×東北細毛羊（♀）（簡稱杜東組）、小尾寒羊（）×東北細毛羊（♀）（簡稱小東組）2個雜交組合中選取出生日期相近，并在相同飼養(yǎng)條件下生長的10月齡育肥羊，屠宰后采集背最長肌、胸肌、腹肌3個部位的樣品，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、純化試劑盒、6×DNA loading buffer、DL 2000dNA Marker、PCR Master Mix、瓊脂糖、RNAiso Plus、SYBRgreen Realtime PCR Master Mix等均為Takara公司產(chǎn)品。9700PCR儀和Mx3000P實時熒光定量PCR儀；Tanon2000凝膠成像系統(tǒng)；紫外分光光度計（GeneQuantⅡ，Pharmacia Biotech）。

1.3 熒光定量PCR

1.3.1 總RNA提取和cDNA的合成 肌肉總RNA的提取按Trizol法進行，RNA樣品經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，用核酸濃度測定儀檢測提取的總RNA濃度。cDNA第1鏈合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進行，PCR反應(yīng)體系：模版cDNA 2μL，F(xiàn)orward Primer 2μL，Reverse Primer 2μL，2×Taq MasterMix25μL，RNase Freeh2O 19μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，26個循環(huán)；72℃延伸2min。-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上公布的綿羊MyoD mRNA和β-actin mRNA序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計MyoD mRNA和β-actin mRNA的引物，由大連寶生物工程公司合成，熒光定量目的基因的引物信息見表1。

1.3.3 熒光實時定量PCR采用SYBR熒光染料法，使用熒光定量PCR儀進行熒光定量，根據(jù)SYBRgreen Realtime PCR Master Mix建立PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)總體系為20μL：其中10μL SYBRgreen Realtime PCR Master Mix，0.8μL PCR Forward Primer（10μM），0.8μL PCR Reverse Primer（10μM），2μL cDNA模板，6.4μLddH2O。95℃預(yù)變性1min。PCR循環(huán)參數(shù)：變性95℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，45s，循環(huán)40次，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照，用于標準曲線的標準品和待測樣品（各重復(fù)3次）。

表1 熒光定量的目的基因的引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

參照Winer等方法，利用2-ΔΔCt法測定MyoD基因的相對表達水平，β-actin為內(nèi)參基因校準；對獲得的數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

由表2可見，MyoD基因mRNA在2種不同雜交組合肉羊的胸肌、腿肌和背最長肌中均有表達，說明該基因不僅是調(diào)控純種地方綿羊肌肉肉質(zhì)的候選基因，也是調(diào)控雜交肉羊肌肉肉質(zhì)的候選基因。MyoD基因mRNA在杜東組試驗羊胸肌、腿肌、背最長肌中的表達水平均顯著高于小東組試驗羊同一部位的表達水平（P＜0.05），且分別為小東組試驗羊相應(yīng)部位肌肉中表達量的1.96倍、6.30倍和1.48倍。MyoD基因mRNA在杜東組試驗羊肌肉組織中的表達量為后腿?。颈匙铋L肌＞胸肌，而其在小東組試驗羊肌肉組織中的表達量為背最長?。拘丶。竞笸燃?，說明雜交肉羊的主要產(chǎn)肉部位發(fā)育受其父本的影響較大。

表2 2種雜交組合肉羊不同部位肌肉中MyoD基因的相對表達量

3 討論

動物的產(chǎn)肉潛力及肌肉品種與肌纖維數(shù)量和生長密切相關(guān)，所有脊椎動物在出生后，其肌肉中的肌纖維數(shù)量是恒定的，即其肌纖維數(shù)量是胎兒期形成的，動物生后的肌肉生長主要依賴于肌衛(wèi)星細胞的增殖分化而導(dǎo)致肌纖維長度和周徑增加，而不是依賴于肌細胞數(shù)量的增殖［6］。MyoD基因是調(diào)控肌肉生成的重要基因，其表達對維持肌細胞分化有重要作用，胚胎期MyoD基因缺失可導(dǎo)致成肌細胞的增殖和分化無法進行［7］。而MyoD基因在動物出生后的主要作用則起到促進多種類型細胞轉(zhuǎn)換為成肌細胞，能促使成肌細胞融合成肌管，進而促進骨骼肌的生長發(fā)育［8］。

Brune等［9］研究發(fā)現(xiàn)，MyoD基因在不同類型的肌肉組織中有不同的表達模式，并認為這種差異來自于肌肉組織的起源不同。胸肌和腿肌在起源和形成過程中存在一定的差異，胸肌主要是由軸下生肌節(jié)的成肌細胞融合而成，腿肌則是由軸下生肌節(jié)的成肌細胞遷移到肢芽處分化而成的。陶志云等［10］對高郵鴨和金定鴨胚胎期的骨骼肌發(fā)育作用的研究中發(fā)現(xiàn)，MyoD基因在不同肌肉中具有不同的表達模式。而本試驗也表明，杜東組和小東組肉羊3個不同部位的肌肉中存在MyoD基因mRNA的表達差異。

中國是全世界最大的綿羊飼養(yǎng)國和羊肉第一生產(chǎn)大國。雖然中國有140個綿山羊品種，但固有的綿山羊地方品種中沒有專門化的肉用綿羊品種，所生產(chǎn)的羊肉平均胴體重僅為15kg左右。因此，全國各地在發(fā)展肉羊生產(chǎn)時，已經(jīng)開始關(guān)注產(chǎn)肉性狀和肉質(zhì)性狀的選育與提高。馬海玉等對阿勒泰羊MyoD基因的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)肉性狀的關(guān)聯(lián)性進行了分析，證實MyoD基因可以作為阿勒泰肉羊產(chǎn)肉性能的候選基因［11］。由于目前國內(nèi)在肉羊生產(chǎn)中普遍采用國外引進優(yōu)質(zhì)良種與地方品種的經(jīng)濟雜交模式，但在雜交組合篩選中很少關(guān)注不同雜交組合不同部位肌肉的發(fā)育狀況，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，杜東組羊主要產(chǎn)肉部位MyoD基因表達水平顯著高于小東組羊，正好證實了國外引進的專門化肉用綿羊品種改良本地羊后，可以促使雜種機體的主要產(chǎn)肉部位肌肉優(yōu)先發(fā)育的現(xiàn)象，為國內(nèi)進一步開展肉羊雜交改良父本品種的選擇提供了理論依據(jù)。

［1］郭月英，任霞，張靜，等.巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)的相關(guān)性研究［J］.食品工業(yè)科技，2014（5）：126-129.

［2］李永平，梁炳生.MyoD肌形成作用機制研究進展［J］.國際骨科學(xué)雜志，2007，28（1）：37-40.

［3］朱礪，李學(xué)偉，帥素容，等.MyoD基因在不同豬種中的分布及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，38（1）：1-7.

［4］楊燕軍，白亮，龐衛(wèi)軍，等.不同豬品種肌肉組織FoxO1與MyoD基因mRNA的表達及其相關(guān)性分析［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2008，24（3）：257-261.

［5］田璐，許尚忠，岳文斌，等.MyoD基因?qū)θ馀ｋ伢w性狀影響的分析［J］.遺傳，2007，29（3）：313-318.

［6］張海軍，陳宏，房興堂，等.山羊MyoD基因家族多態(tài)性及與體尺性狀的相關(guān)性［J］.遺傳，2007，29（9）：1077-1082.

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［8］王瓊，朱慶.肌肉生長相關(guān)因子MyoD基因的研究進展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007（4）：23.

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［10］陶志云，鄒劍敏，宋遲，等.鴨胚骨骼肌生肌調(diào)節(jié)因子MyoD1和Myf5發(fā)育性變化的研究［J］.中國家禽，2012，34（17）：16-19.

［11］馬海玉，臧長江，田佳，等.阿勒泰羊MyoD基因的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)肉性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（11）：218-222.

Expression of MyoD Gene mRNA in the Muscle Tissues of Different Hybrid Mutton Sheep

XiangLujie，Sun Limin，JiangHuaizhi，et al
（College ofAnimal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Myogenic determination gene（MyoD）is one of the dominant genes in muscle development in vertebrate embryonic.In order to study the expression of MyoD mRNA in the muscle tissues of different breeds of sheep，the bybrids of Dorper sheep and Small Tail Han Sheep with Northest Fine Wool sheep were used todetect the expression ofMyoD byfluorescence quantitative PCR reaction.The results showed that MyoD gene expression in the pectoral muscle，leg muscle and longissimus muscle in different groups had significant difference(P＜0.05)；the relative expression in pectoral muscle of MyoD in DD（hybrid of Dorper sheep with Northest Fine Wool sheep）group was 1.96 times as much as the relative expression ofMyoD in XD（hybrid of Small Tail Han sheep with Northest Fine Wool sheep），the relative expression in leg muscle of MyoD in DD group was 6.30 times as much as that in XD，the relative expression in longissimus muscle ofMyoD in DDgroup was 1.48 times as much as that in XD.

mutton sheep；MyoD；gene expression

S826.2

A

2095-3887（2015）05-0001-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.05.001

2015-05-20

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20110237）、（20120802）

項露頡（1992-），女，碩士研究生。

姜懷志（1968-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事綿山羊遺傳育種方面的研究工作。