黃連素對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥的影響

趙 俊 張溪林 何力敏 陳于犖 明凱華

1.廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東廣州 510180；2.廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510180

黃連素對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥的影響

趙 俊1張溪林1何力敏1陳于犖1明凱華2

1.廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東廣州 510180；2.廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510180

目的探討不同劑量黃連素對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型大鼠氣道炎癥的影響。方法 50只清潔級雄性Wistar大鼠隨機分為生理鹽水對照組、COPD模型組和低劑量（25 mg/kg）、中劑量（50 mg/kg）、高劑量（100 mg/kg）黃連素組，每組各10只。通過氣管注射內(nèi)毒素加熏香煙方法建立大鼠COPD模型。采集左肺支氣管肺泡灌洗液，利用瑞氏-吉姆薩染色法行中性粒細胞（PMN）、肺泡巨噬細胞（AM）計數(shù)；ELISA法檢測IL-8、IL-10、IL-17含量。結果COPD模型組大鼠支氣管肺泡灌洗液中的PMN、AM計數(shù)及IL-8、IL-17含量顯著高于生理鹽水對照組（P＜0.01）；IL-10含量顯著低于生理鹽水對照組（P＜0.01）。而不同劑量黃連素干預后PMN、AM計數(shù)，IL-8、IL-17水平有不同程度下降（P＜0.01），IL-10水平有不同程度升高（P＜0.01），且黃連素劑量越高，此效應越明顯。結論不同劑量黃連素均可抑制COPD模型大鼠的氣道炎癥，其機制可能與黃連素下調(diào)炎癥因子IL-8、IL-17水平，增強抗炎因子IL-10水平這一途徑有關，且此效應與黃連素劑量呈正相關。

慢性阻塞性肺疾??；黃連素；氣道炎癥；白細胞介素

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）在我國是一種常見病、多發(fā)病，COPD的發(fā)病機制復雜，其中多種炎癥細胞因子、炎癥介質(zhì)等相互作用所產(chǎn)生的慢性氣道炎癥被認為是COPD主要發(fā)病機制[1]。反復慢性氣道炎癥可致氣道結構破壞、黏液分泌增加，最終氣流受限呈不完全可逆。COPD發(fā)病率、死亡率較高，治療費用昂貴，已成為當今廣泛關注的公共衛(wèi)生問題之一。目前臨床上治療COPD的藥物療效有限，尋找到新的藥物迫在眉睫，利用細胞因子受體拮抗劑抑制氣道炎癥可能是今后臨床應用的趨勢和方向。現(xiàn)已知IL-8主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生，主要的生物學活性是吸引和激活中性粒細胞，導致機體局部炎性反應；IL-10主要由Th2細胞和單核巨噬細胞產(chǎn)生，能夠抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，具有抗炎作用；IL-17是T細胞誘導的致炎細胞因子，可促進前炎癥細胞因子的釋放，導致炎性反應持續(xù)。研究表明，IL-8、IL-10、IL-17與COPD疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[2-3]。我國傳統(tǒng)中藥黃連素具有廣譜抗菌作用，且價格低廉，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)黃連素還具有較強的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[4]。本研究采用大鼠COPD疾病模型，觀察不同劑量黃連素對大鼠氣道炎癥因子IL-8、IL-10、IL-17的影響并探討其作用機制，為COPD的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

黃連素片（杭州民生藥業(yè)有限公司），LPSE.coli055：B5（美國Sigma公司），大鼠白介素（IL）-8、IL-10、IL-17酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國BPB公司）。

1.2 實驗動物分組

由中山醫(yī)科大學動物實驗中心提供健康雄性SPF級Wistar大鼠50只，平均體重（218±12）g，鼠齡11周。隨機化原則分為COPD模型組、低劑量黃連素組（25 mg/kg）、中劑量黃連素組（50 mg/kg）、高劑量黃連素組（100 mg/kg）和生理鹽水對照組，各10只。

1.3 COPD疾病模型建立

COPD疾病模型建立參考李紅梅等[5]的方法，用持續(xù)熏香煙加間斷氣管內(nèi)注射脂多糖（LPS）方法：COPD模型組分別于第1、14天在大鼠麻醉、固定、暴露聲門后將膠管置入氣管，經(jīng)膠管注入LPS 200 μg（1 g/L）。在第2～28天將大鼠置入熏煙箱內(nèi)，熏5%香煙，每天0.5 h，共28 d。生理鹽水對照組不予熏煙，從第1天起每天霧化吸入生理鹽水0.5 h。黃連素干預組從第1天起每天1次分別給予黃連素25、50、100 mg/kg灌胃，其余實驗操作與COPD疾病模型組一致。

1.4 標本收集

以10%水合氯醛（50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，暴露雙肺，無菌細管置入左肺主支氣管，行支氣管肺泡灌洗，每次注入4 mL 4℃生理鹽水，保留3 min后回收經(jīng)單純紗布過濾，反復3次。將收集的支氣管肺泡灌洗液 （BALF）混勻后于低溫離心機中 （4℃，1200 r/min）離心5 min，分裝上清液置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。沉渣涂于干凈玻片上，進行瑞氏-吉姆薩染色（Wright-Gimosa），染色后在光鏡下分別進行細胞總數(shù)和中性粒細胞、肺泡巨噬細胞分類計數(shù)。

1.5 BALF中IL-8、IL-10、IL-17水平測定

按試劑盒說明書進行操作，在分別包被有抗大鼠IL-8、IL-10、IL-17單抗的酶標板上，采用ELISA法檢測，分別計算BALF中IL-8、IL-10、IL-17濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)

與生理鹽水對照組比較，COPD模型組大鼠BALF內(nèi)的細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)明顯升高（P＜0.01）；低、中、高劑量黃連素處理后的BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)較COPD模型組不同程度降低（P＜0.01），且黃連素劑量越高，細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)越低。見表1。

表1 各組大鼠BALF中細胞總數(shù)堯中性粒細胞數(shù)堯巨噬細胞數(shù)計數(shù)比較（×108個/L，）

表1 各組大鼠BALF中細胞總數(shù)堯中性粒細胞數(shù)堯巨噬細胞數(shù)計數(shù)比較（×108個/L，）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.01，與COPD模型組比較，#P＜0.01；COPD：慢性阻塞性肺病

組別 只數(shù) 細胞總數(shù) 中性粒細胞數(shù) 巨噬細胞數(shù)生理鹽水對照組COPD模型組低劑量黃連素組中劑量黃連素組高劑量黃連素組10 10 10 10 10 1.68±0.22 6.15±0.64*4.25±0.23#2.72±0.39#2.12±0.46#0.09±0.01 0.57±0.12*0.23±0.04#0.18±0.06#0.10±0.08#0.84±0.52 4.58±0.31*3.02±0.56#1.57±0.28#1.12±0.25#

2.2 BALF中細胞因子IL-8、IL-10、IL-17水平的變化

與生理鹽水對照組比較，COPD模型組大鼠BALF中的細胞因子IL-8、IL-17水平明顯升高，IL-10水平明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而不同劑量黃連素處理后IL-8、IL-17水平較COPD模型組有不同程度降低 （P＜0.01），IL-10水平有不同程度升高（P＜0.01），且黃連素劑量越高，此效應越明顯。見表2。

表2 各組大鼠BALF中IL-8堯IL-10堯IL-17水平比較（ng/L，）

表2 各組大鼠BALF中IL-8堯IL-10堯IL-17水平比較（ng/L，）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.01，與COPD模型組比較，#P＜0.01；COPD：慢性阻塞性肺?。籌L：白介素

組別 只數(shù) IL-8 IL-10 IL-17生理鹽水對照組COPD模型組低劑量黃連素組中劑量黃連素組高劑量黃連素組10 10 10 10 10 3.34±1.24 10.16±2.86*8.36±1.22#6.72±2.39#5.05±1.61#4.23±0.36 2.30±0.51*3.23±0.34#5.82±0.23#6.10±0.08#35.62±2.32 54.36±3.21*50.02±2.06#42.55±4.20#31.14±3.71#

3 討論

COPD是一種可預防、可治療的常見慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其以氣道持續(xù)氣流受限為特征，呈進行性發(fā)展，晚期可導致肺心病和呼吸衰竭，與氣道和肺臟對有害顆?；蛴泻怏w的慢性異常炎性反應增強有關，其發(fā)病機制復雜，現(xiàn)已明確氣道炎癥是COPD的主要病理生理特征，炎癥細胞釋放的多種細胞因子在COPD氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用[1]。故國內(nèi)外學者對COPD氣道炎癥研究也越來越深入。

IL-8是一種趨化細胞因子，由中性粒細胞、淋巴細胞、肺泡巨噬細胞等分泌，可促進中性粒細胞和T淋巴細胞的趨化。IL-8能吸引中性粒細胞在呼吸道募集和激活，釋放蛋白水解酶，產(chǎn)生氧自由基及花生四烯酸等系列炎性介質(zhì)，促進氣道炎性反應，引起氣道重塑致氣流受限，并在一定程度上反映氣道炎癥的嚴重程度[6]。而中性粒細胞本身又是IL-8重要來源，兩者之間相互促進，具有協(xié)同作用，所以IL-8與中性粒細胞與COPD氣道炎癥密切相關。徐東等[7]發(fā)現(xiàn)，在COPD患者血液、痰液中IL-8的水平升高，且與中性粒細胞水平呈一定正相關性。Bhowmik等[8]發(fā)現(xiàn)COPD患者的痰液、肺泡灌洗液中IL-8水平較正常人明顯升高，且與炎癥細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)呈正相關。本研究結果顯示COPD模型組大鼠BALF中細胞因子IL-8水平較生理鹽水對照組明顯升高，與國內(nèi)外學者研究結果相一致，說明IL-8可促進COPD模型組大鼠氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

IL-17是新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子，主要由CD4+T淋巴細胞、單核細胞等分泌的一種前炎癥細胞因子，在中性粒細胞的募集和激活中發(fā)揮著強大的化學趨化作用。IL-17與多種細胞因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生協(xié)同作用以放大炎性反應，導致炎癥瀑布效應。體外研究發(fā)現(xiàn)，IL-17與其他前炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子（TNF-α）產(chǎn)生協(xié)同作用，能促進IL-6、IL-8、細胞黏附分子-1等的產(chǎn)生[9]。Barczyk等[10]發(fā)現(xiàn)，在慢性支氣管炎和哮喘急性發(fā)作期患者的痰液標本中IL-17水平明顯增加。本研究結果顯示，與生理鹽水對照組比較，COPD模型組大鼠BALF中細胞因子IL-17水平明顯升高。同時也發(fā)現(xiàn)，相對于生理鹽水對照組，COPD模型組大鼠BALF中的IL-8水平明顯升高，說明IL-17、IL-8在COPD模型組大鼠氣道炎癥中可能共同發(fā)揮作用，是COPD患者發(fā)病的重要致炎因子，相互促進，加速氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

與IL-8、IL-17促炎因子不同，IL-10是一種有效的抗炎因子，主要由Th2細胞、活化的B細胞、單核巨噬細胞產(chǎn)生，參與免疫應答和免疫調(diào)節(jié)，在感染性、自身免疫性疾病、腫瘤及移植免疫等多種疾病中發(fā)揮重要作用，其生物學功能主要是抑制單核細胞、巨噬細胞產(chǎn)生致炎介質(zhì)，促進抗炎介質(zhì)的增加。有研究表明，IL-10還能抑制與破壞肺彈性纖維有關的基質(zhì)金屬蛋白酶[11]。有研究者認為，COPD患者血清和肺組織中IL-10的水平低下可能與COPD的發(fā)生、發(fā)展有關[3]。朱崢等[11]發(fā)現(xiàn)，在COPD急性加重期患者吸入激素及激素聯(lián)合β受體激動劑治療前后誘導痰IL-10的水平存在差異，治療后誘導痰IL-10水平升高更為明顯。李曉莉等[12]發(fā)現(xiàn)，在重度穩(wěn)定期COPD患者吸入沙美特羅/氟替卡松治療90 d后的呼出氣冷凝液中IL-10水平較治療28 d顯著升高，提示IL-10可能有拮抗氣道炎癥的作用，有望成為一種抗炎藥物用于慢阻肺的治療。本研究結果顯示，COPD模型組大鼠BALF中細胞因子IL-10水平較生理鹽水對照組明顯下降，表明IL-8、IL-17作為促炎因子，IL-10作為抑炎因子，它們之間的表達平衡失調(diào)可能在COPD氣道炎性反應中起著重要作用。

隨著人口的老齡化、空氣污染的日益加劇，我國COPD患者的發(fā)病率和死亡率逐年增加，且醫(yī)療成本日益升高，目前臨床上使用的藥物療效有限，尋找到新的藥物迫在眉睫。由于慢性氣道炎癥在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且COPD患者的發(fā)病與其體內(nèi)細胞因子的調(diào)控失衡密切相關，利用細胞因子及其受體拮抗劑抑制氣道炎癥可能是今后COPD防治的趨勢和方向。

黃連素是一種從黃連等植物中提取出的異喹啉類生物堿，在亞洲分布較為廣泛，在我國作為中草藥應用歷史悠久，具有廣譜抗菌作用，臨床上主要用于清熱解毒和治療腸道感染[13]，其價格低廉，無明顯不良反應。目前研究還發(fā)現(xiàn)黃連素有較強的抗炎和一定的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。黃連素可負向調(diào)節(jié)炎癥細胞因子和炎性介質(zhì)的釋放，例如白介素（ILs）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列腺素（PGs）等，其抗炎機制可能與黃連素能抑制炎癥過程中的轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活化信號途徑有關。Jiang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素能抑制LPS誘導的NF-κB信號途徑活化和炎性反應進展。本研究結果發(fā)現(xiàn)，不同劑量（25、50、100 mg/kg）的中藥黃連素均能使COPD大鼠BALF中中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)計數(shù)及IL-8、IL-17水平明顯下降，IL-10水平明顯上升。說明黃連素可能通過啟動機體的免疫機制，下調(diào)炎癥因子IL-8、IL-17水平，上調(diào)抗炎因子IL-10水平這一途徑來抑制氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著黃連素干預劑量的增加，COPD大鼠BALF中中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)計數(shù)及IL-8、IL-17水平下降越明顯，IL-10水平上升越明顯，呈一定的正向劑量-效應關系。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)不同劑量黃連素均可抑制COPD模型大鼠的氣道炎癥，其機制可能與黃連素下調(diào)炎癥因子IL-8、IL-17水平、增強抗炎因子IL-10水平這一途徑有關，且此效應與黃連素劑量成一定正相關，提示黃連素可能成為一種治療COPD的有效且便宜的藥物，其抗炎的具體分子機制、所涉及的細胞信號通路尚有待進一步實驗研究。

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Effects of Berberine on the airway inflammation of rats with chronic obstructive Pulmonary disease

ZHAO Jun1ZHANG Xilin1HE Limin1CHEN Yuluo1MING Kaihua2

1.Department of Geratology,Guangzhou First Municipal People's Hospital,Guangdong Province,Guangzhou 510180, China;2.Department of Laboratory Medicine,Guangzhou First Municipal People's Hospital,Guangdong Province, Guangzhou 510180,China

Objective To investigate the effects of Berberine on the airway inflammation of rats with chronic obstructive pulmonary disease.Methods Fifty male and healthy Wistar rats were randomly divided into five groups,with 10 rats in each group,including NS control group,COPD group and 25,50,100 mg/kg Berberine group.Chronic obstructive pulmonary disease rats models were established by passive cigarette smoking plus intratracheal instillation of lipopolysaccharide.Bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of left lung sample were collected.Polymorphonuclear(PMN)and alveolar macrophage (AM)counts in BALF were measured with Wright-Giemsa staining method.Interleukin-8 (IL-8),interleukin-10(IL-10),interleukin-17(IL-17)were detected with enzyme linked immunosorbent assay.Results The levels of PMN,AM counts and IL-8,IL-17 levels were significantly increased in BALF of COPD model group compared with saline control group(P＜0.01),however,the level of IL-10 was just on the contrary(P＜0.01).After intervention with different doses of Berberine,compared with COPD model group,the levels of PMN,AM counts and IL-8,IL-17 levels were significantly decreased in BALF (P＜0.01),however,the level of IL-10 was increased to varying degrees (P＜0.01),and the higher the dose of Berberine,this effects were more obvious.Conclusion Different doses of Berberine can inhibit the airway inflammation of COPD rat model.The mechanism is associated with Berberine lowered levels of inflammatory cytokine IL-8,IL-17 and enhance the level of anti-inflammatory cytokine IL-10,and this positive effect of Berberine is related to its dose.

Chronic obstructive pulmonary disease;Berberine;Airway inflammation;Interleukin

R563

A

1673-7210（2015）11（a）-0040-04

2015-05-04本文編輯：程 銘）

趙?。?978.9-），碩士，副主任醫(yī)師；研究方向：COPD發(fā)病機制研究。