內皮祖細胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化

石 峰 李冬梅 楊銳睿 蘇玉靜 費秀靜

1.河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市開灤職業(yè)病防治院耳鼻喉科，河北唐山 063301；3.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河北唐山 063100；4.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院手術室，河北唐山 063100；5.河北省唐山市開灤總醫(yī)院趙各莊醫(yī)院外科，河北唐山 063100

內皮祖細胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化

石 峰1李冬梅2楊銳睿3蘇玉靜4費秀靜5

1.河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市開灤職業(yè)病防治院耳鼻喉科，河北唐山 063301；3.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河北唐山 063100；4.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院手術室，河北唐山 063100；5.河北省唐山市開灤總醫(yī)院趙各莊醫(yī)院外科，河北唐山 063100

目的探討內皮祖細胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化。方法50只SD大鼠分為兩組，其中空白對照組10只，實驗組40只?？瞻讓φ战M不做處理，實驗組進行噪聲暴露構建噪聲性耳聾動物模型，并按照暴露時間分為4組，分別為暴露后即刻組和暴露后1 d組、暴露后7 d組、暴露后14 d組，每組各10只。分別檢測各組動物的外周血內皮祖細胞水平和血管內皮生長因子、誘導型一氧化氮合酶及CD34水平，并進行比較。結果暴露后即刻組和暴露后1 d組、暴露后7 d組的外周血內皮祖細胞水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。暴露后1 d組、暴露后7 d組的血管內皮生長因子表達水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但暴露后即刻組、暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。免疫組化結果顯示：實驗組噪聲暴露后即刻、暴露后l d的CD34均呈微弱表達，噪聲暴露后7 d呈強表達；噪聲暴露后14 d呈陽性表達；噪聲暴露后即刻的誘導型一氧化氮合酶呈微弱表達，暴露后1 d呈強表達，暴露后7、14 d組呈陽性表達。經掃描電鏡結果顯示：空白對照組動物的內耳內外毛細胞均呈現(xiàn)出整齊排列的情況，暴露后即刻組、暴露后1 d組可見內耳毛細胞呈現(xiàn)出紊亂狀態(tài)，暴露后7 d組、暴露后14 d組，經觀察動物耳蝸第二圈可見外毛細胞呈現(xiàn)出紊亂、缺失等現(xiàn)象。結論噪聲性耳聾會導致耳蝸損傷的出現(xiàn)，內皮祖細胞數(shù)量會隨著時間的變化發(fā)生改變，并在耳蝸損傷修復中發(fā)揮重要作用。

噪聲性耳聾；耳蝸損傷；內皮祖細胞；變化

現(xiàn)如今，噪聲已經成為一大污染因素，它不但會影響人們的情緒波動甚至會對人體健康造成嚴重的危害，很多耳鳴耳聾患者屬于噪聲性耳聾[1]。噪聲性耳聾會對患者的耳蝸造成不同程度的損傷，導致耳蝸微血管出現(xiàn)收縮，并進一步導致耳蝸缺血和缺氧等情況的出現(xiàn)[2-3]。隨著血管內皮祖細胞相關理論和研究的深入，內皮祖細胞與耳蝸損傷及在內皮化相關問題受到關注，并為臨床噪聲性耳聾的治療等提供了新思路。本研究通過構建動物模型的方式，探討內皮祖細胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

50只SD大鼠，由南京君科生物工程有限公司提供，雌雄各半，體重16～20 g，年齡7 d。本研究相關內容和方法均經醫(yī)院倫理部門審核并批準，實驗設計方案、使用動物品種品系規(guī)格、處死動物的方法、項目進行中設計動物福利和倫理問題等均符合要求。

1.2 試劑與儀器

半胱氨酸：揚子江藥業(yè)集團有限公司；磷酸鹽緩沖液：上海士鋒生物科技有限公司；中性樹膠：上海佳和生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺：北京索萊寶科技有限公司；異硫氰酸熒光素：廣州蕊特生物科技有限公司；辣根過氧化物酶：上海鈺博生物科技有限公司；牛血清白蛋白：上海天承生物科技有限公司；胞流式細胞儀：江蘇奧凱醫(yī)療設備有限公司；超低溫冰箱：上海蔡康光學儀器有限公司；倒置相差顯微鏡：香港龍達生物科技有限公司；解剖鏡顯微鏡：上海研謹生物科技有限公司；電子天平：上海百研生物科技有限公司；封閉血清：上海士鋒生物科技有限公司；掃描電鏡：東莞市協(xié)美電子有限公司。

1.3 方法

將50只大鼠隨機分為兩組，其中空白對照組10只，實驗組40只?？瞻讓φ战M不做處理，實驗組進行噪聲暴露構建噪聲性耳聾動物模型[4]，并分為4組，分別為暴露后即刻組和暴露后1 d組、暴露后7 d組、暴露后14 d組，每組各10只。分別收取各組的外周血，檢測各組動物的外周血內皮祖細胞水平。利用免疫印記法檢測血管內皮生長因子，并進行組組學觀察，了解誘導型一氧化氮合酶和CD34陽性表達情況[5]。利用掃描電鏡對各組動物進行內耳掃描，觀察其內外毛細胞排列情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血內皮祖細胞水平檢測結果

暴露后即刻組、暴露后1 d組、暴露后7 d組的外周血內皮祖細胞水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組外周血內皮祖細胞水平檢測結果

2.2 各組血管內皮生長因子表達水平檢測結果

暴露后1 d組、暴露后7 d組的血管內皮生長因子表達水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但暴露后即刻組、暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組血管內皮生長因子表達水平檢測結果分析

2.3 實驗組誘導型一氧化氮合酶和CD34表達情況

免疫組化結果顯示：實驗組噪聲暴露后即刻、l d的CD34均呈微弱表達，噪聲暴露后7 d呈強表達；噪聲暴露后14 d呈陽性表達（圖1）。噪聲暴露后即刻誘導型一氧化氮合酶呈微弱表達，噪聲暴露后1 d呈強表達，噪聲暴露后7、14 d呈陽性表達（圖2）。

圖1 實驗組誘導型一氧化氮合酶免疫組化（100×）

圖2 實驗組CD34免疫組化（100×）

2.4 各組掃描電鏡觀察結果

經掃描電鏡觀察，空白對照組動物的內耳內外毛細胞均呈現(xiàn)出整齊排列的情況（圖3A），暴露后即刻組、暴露后1 d組可見內耳毛細胞呈現(xiàn)出紊亂狀態(tài)（圖3B、C），其中內毛細胞倒伏散亂融和，外毛細胞倒伏散亂；暴露后7 d組經觀察耳蝸第二圈可見外毛細胞呈現(xiàn)出紊亂缺失情況（圖3D）；暴露后14 d組可觀察到外毛細胞呈紊亂狀態(tài)，且存在部分缺失現(xiàn)象（圖3E）。

圖3 各組掃描電鏡觀察結果

3 討論

噪聲是導致聽力殘疾的重要原因之一，主要來源有工業(yè)噪聲、建筑施工噪聲、交通運輸噪聲和社會生活噪聲[5]。其中，近年來包括娛樂性噪聲在內的社會生活噪聲對聽力的危害最常見。伴隨手機、平板電腦等電子產品的普及以及歌廳、酒吧等娛樂場所增多，社會公眾特別是青少年因不當使用發(fā)生噪聲性聽力損傷的風險日益加大，導致噪聲性耳聾發(fā)病率的不斷上升[6]。噪聲嚴重危害人體健康。持久的過強的噪聲會對中樞神經系統(tǒng)產生不良的影響，并影響許多器官的活動。噪聲環(huán)境對耳蝸的毛細胞損傷是積累的，長期的噪聲環(huán)境刺激會造成耳蝸毛細胞的損傷，導致耳蝸功能與形態(tài)學發(fā)生改變，如耳蝸微音電位振幅的降低，以及掃描電鏡觀察到的耳蝸毛細胞靜纖毛排列紊亂等，而且這種損傷是不可逆的[7]。

血管內皮細胞是一種單層連續(xù)細胞，覆蓋在血管內腔的表面，可以發(fā)揮出一定的血管屏障作用，并具有諸多其他生物學功能[8-9]。在受損和刺激影響下，血管內皮細胞可以表達出各種凝血因子，對血液的凝固產生極大的促進作用。一定的情況下，血管內皮細胞還分泌和釋放出大量的纖溶酶原激活物抑制物，對血栓的溶解產生抑制作用[10]。血管內皮細胞可以對血管張力予以調節(jié)，分泌的一氧化氮等物質可以使血管發(fā)生平滑肌舒張。且血管內皮細胞產生的內皮素則可以引起血管的有效收縮[11]。于是，通過不同途徑，血管內皮細胞可以對血管的張力以及血流速度等予以不同的調節(jié)。另外，內皮細胞所產生前列環(huán)素可以對血小板產生作用，發(fā)揮出較強的抗血小板活化作用，并促進血管的舒張。血管內皮細胞還可以合成并表達凝血酶調節(jié)蛋白，達到抗凝血的目的[12]。血管內皮細胞還可以合成組織因子途徑抑制物，有效抑制外源性凝血途徑。如果出現(xiàn)血管出血的情況，內皮細胞就會大量釋放內皮素，通過收縮血管達到止血的目的[13]。血管內皮一旦受損，會影響血管釋放一氧化氮和內皮素，血管的收縮和擴張功能就會受影響[14]。

內皮祖細胞來源于骨髓，內皮祖細胞能增殖并分化為血管內皮細胞，不僅參與人胚胎血管生成，同時也參與出生后血管新生和內皮損傷后的修復過程。內皮祖細胞是內皮細胞的前體細胞，內皮祖細胞受損可能與多種疾病發(fā)病密切相關，這些疾病包括高血壓、冠心病、糖尿病、慢性腎功能衰竭等。內皮祖細胞可以隨著血液在血管內流動，可以快速修復受損的內皮，形成功能化內皮層，構筑天然屏障，降低炎癥發(fā)生概率，并防止血栓形成。如果出現(xiàn)組織缺血損傷的情況，內皮祖細胞便會結合到血管再生部位，并通過增殖、分化，產生大量的內皮細胞，并積極促進局部新生血管形成[15-16]。楊東等[17]對老年性耳聾患者于正常健康老年人外周血中的內皮祖細胞數(shù)量和增殖集落變化情況等進行了檢測和比較發(fā)現(xiàn)，在內皮祖細胞數(shù)量和增殖集落數(shù)量方面，與正常健康老年人比較，老年性耳聾患者均出現(xiàn)下降的情況，提示人體內皮祖細胞的變化與老年性耳聾之間具有十分密切的聯(lián)系，可以為其治療和研究提供極大的促進作用。而血管再生受到不同生長因子的影響，其中包括血管內皮生長因子等[18]。一旦出現(xiàn)組織損傷，便會促使血管內皮生長因子和一氧化氮等的表達，進而實現(xiàn)對內皮細胞遷移和增殖的積極影響等[19]。王偉等[20]通過構建動物模型的方式，分析轉染血管內皮生長因子基因對內皮祖細胞生長的影響。研究發(fā)現(xiàn)，轉染血管內皮生長因子基因可以對內皮祖細胞的生長產生十分積極的影響，有效促進其增殖能力的提高。

人體內耳的聽覺細胞是一種感受聽覺的纖毛細胞，易受噪聲影響，損傷后不能再生。長期噪聲刺激使耳蝸血管紋出現(xiàn)血循環(huán)障礙，嚴重者內皮細胞損傷，繼之螺旋神經節(jié)發(fā)生退行性病變，病變部位以耳蝸基底圈末端及第二圈病變最為嚴重。其中，在毛細胞損傷過程方面，首先是外毛細胞受損，其次是內毛細胞。本次研究結果也顯示，經掃描電鏡觀察，空白對照組大鼠的內耳內外毛細胞均呈現(xiàn)出整齊排列的情況，而暴露后即刻組、暴露后1 d組可見內耳毛細胞呈現(xiàn)出紊亂狀態(tài)，其中內毛細胞倒伏散亂融和，外毛細胞倒伏散亂；暴露后7 d組和暴露后14 d組，經觀察動物耳蝸第二圈可見外毛細胞呈現(xiàn)出紊亂、缺失等現(xiàn)象。隨著損傷持續(xù)存在、聽力進一步出現(xiàn)其他頻率的下降。在噪聲的影響下，人體耳蝸的血管內皮細胞腫脹，血管內皮細胞功能紊亂，血管腔變狹，血液流速減慢，血量減少，導致耳蝸損傷的出現(xiàn)。為此，在對噪聲性耳聾患者進行治療的過程中，在修復耳蝸損傷的時候，可以積極的采取有效措施予以血管內皮細胞修復。本研究中，對不同噪聲暴露時間下實驗大鼠的外周血內皮祖細胞水平和血管內皮生長因子、誘導型一氧化氮合酶和CD34水平進行檢測，并對空白對照組進行比較。研究結果顯示，實驗組暴露后即刻、暴露后1、7 d的外周血內皮祖細胞和血管內皮生長因子水平均顯著高于空白對照組，且經免疫組化結果顯示，噪聲暴露后即刻、l d的CD34均呈微弱表達，噪聲暴露后7 d呈強表達，噪聲暴露后14 d呈陽性表達。噪聲暴露后即刻誘導型一氧化氮合酶呈微弱表達，噪聲暴露后1 d呈強表達，噪聲暴露后7、14 d呈陽性表達。這些表明，在出現(xiàn)耳蝸損傷之后，外周祖細胞便會由骨髓釋放，并大量進入血循環(huán)之中，并積極的參與到耳蝸損傷的修復之中。通過研究還發(fā)現(xiàn)，到暴露后14 d，實驗組外周血內皮祖細胞和血管內皮生長因子水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明內皮祖細胞與血管內皮生長因子以及CD34的共同作用，可以有效促進成熟內皮細胞的分化，從而顯著增加耳蝸新生內皮細胞數(shù)量，達到有效修復受損序血管的效果。

綜上所述，噪聲性耳聾會導致耳蝸損傷的出現(xiàn)，內皮祖細胞數(shù)量會隨著時間的變化發(fā)生改變，并在耳蝸損傷修復中發(fā)揮重要作用。

[1]孫剛，劉虹，楊彩鳳.外周血內皮祖細胞在老年突發(fā)性耳聾患者中的數(shù)量變化及其臨床意義[J].重慶醫(yī)學，2014，43（13）：1634-1636.

[2]張建江，鄭莉萍，王華，等.血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對大鼠外周血內皮祖細胞培養(yǎng)的影響[J].中華腎臟病雜志，2010，26（12）：915-919.

[3]王士禮.噪聲性耳聾功能與形態(tài)學改變及其相互間關系的研究[D].上海：上海第二醫(yī)學院，1989.

[4]馬重兵，朱田田，李秋明，等.針刺對噪聲性耳聾大鼠耳蝸毛細胞VEGF表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（8）：2050-2052.

[5]周武，劉國輝，楊述華，等.低強度跑臺運動對大鼠外周血內皮祖細胞數(shù)及內皮型一氧化氮合酶等相關細胞因子的影響[J].中華實驗外科雜志，2015，32（2）：385-387.

[6]徐清波.血管再生中的內皮祖細胞[J].生理學報，2005，57（1）：1-6.

[7]尹揚光，黃嵐，趙曉輝，等.基質細胞衍生因子1α介導小鼠內皮祖細胞修復損傷血管內膜[J].中國動脈硬化雜志，2007，15（1）：6-10.

[8]周建良，鄒明暉，陳義初，等.人臍帶血內皮祖細胞與血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子共培養(yǎng)及其增殖和遷移能力[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（6）：1000-1004.

[9]Yang Z，Xiong K，Qi P，et al.Gallic acid tailoring surface functionalities of plasma-polymerized allylamine-coated 316l ss to selectively direct vascular endothelial and smooth muscle cell fate for enhanced endothelialization[J]. ACS Appl Mater Interfaces，2014，6（4）：2647-2656.

[10]Kimberly D，Solomon JL.Vascular endothelial growth factor attachment to hydroxyapatite via self-assembled monolayers promotes angiogenic activity of endothelial cells[J].Thin Solid Films，2013，537（30）：256-262.

[11]江啟亮.硫化氫對血管內皮細胞功能影響研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志，2015，29（4）：322-324.

[12]底煜，陳曉隆，王愛媛.CCR7和VEGF在缺氧時視網(wǎng)膜血管內皮細胞中的表達及意義[J].國際眼科雜志，2015，15（3）：403-406.

[13]胡雪梅，劉潔，孫力，等.冬凌草甲素對棕櫚酸誘導的內皮細胞損傷的保護作用[J].武漢大學學報：醫(yī)學版，2015，36（3）：329-331.

[14]Su CH，Wu YJ，Chang CY，et al.The increase of vegf secretion from endothelial progenitor cells post ultrasonic vegf gene delivery enhances the proliferation and migration of endothelial cells[J].Ultrasound Med Biol，2013，39（1）：134-145.

[15]馮曉，潘峰，張臘紅，等.Ang-1和Tie2在高血壓患者內皮祖細胞中表達水平及臨床意義研究[J].中國醫(yī)藥導報，2014，11（11）：4-6，9.

[16]涂昌，陳杰民，李淑芬，等.不穩(wěn)定性心絞痛患者冠狀動脈病變程度與外周血內皮祖細胞及高敏C反應蛋白的關系[J].中國醫(yī)藥導報，2013，10（34）：31-34.

[17]楊東，田野，周子偉.老年性耳聾患者外周血EPCs數(shù)量及增殖變化研究[J].中華全科醫(yī)學，2012，10（8）：1198-1200

[18]黨勝春，陳榮芳，王平江，等.一氧化氮合酶基因轉染小鼠內皮祖細胞的實驗研究[J].廣東醫(yī)學，2014，35（22）：3464-3467.

[19]楊東.內皮祖細胞與噪聲性耳聾耳蝸損傷的關系[D].天津：天津醫(yī)科大學，2013.

[20]朱艷含，羅勇，胥虹貝，等.電針介導eNOS動員內源性EPCs促MCAO/R大鼠腦內血管再生[J].中國實驗動物學報，23（3）：291-296.

[21]王偉，劉德紅，李卓成，等.轉染VEGF基因對內皮祖細胞生長的影響研究[J].中國實驗診斷學，2015，19（3）：355-358.

Changes of endothelial Progenitor cells in cochlea of noise deafness

SHI Feng1LI Dongmei2YANG Ruirui3SU Yujing4FEI Xiujing5

1.Department of ENT,Union Hospital of Tangshan City,Hebei Province,Tangshan 063000,China;2.Department of ENT,Occupational Disease Control Institute of Kailuan,Hebei Province,Tangshan 063301,China;3.ICU,Linxi Hospital of Kailuan General Hospital,Hebei Province,Tangshan 063100,China;4.Operation Room,Linxi Hospital of Kailuan General Hospital,Hebei Province,Tangshan 063100,China;5.Department of Surgery,Zhaogezhuang Hospital of Kailuan General Hospital,Hebei Province,Tangshan 063100,China

Objective To explore the changes of endothelial progenitor cells in noise deafness cochlea injure.Methods 50 SD rats were divided into two groups,the blank control group with 10 rats,and the experiment group with 40 rats. Blank control group received no intervention,experiment group exposed to noise and constructed noise deafness animal model,accoding to the exposed time,the rats were divided into four groups,after exposuring immediately group,after exposuring 1 d group,after exposuring 7 d group,after exposuring 14 d group,with 10 rats in each group.The peripheral blood endothelial progenitor cells,blood vascular endothelial growth factor,inducible nitric oxide synthase and CD34 of animals were detected and compared.Results The peripheral blood endothelial progenitor cells in after exposuring immediately group,after exposuring 1 d group and after exposuring 7 d group were higher than that in blank control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);But there was no significant difference between after exposuring 14 d group and blank control group(P＞0.05).The vascular endothelial growth factor expression levels in after exposuring 1 d group,after exposuring 7 d group were higher than that in blank control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);But those in after exposuring immediate group and after exposuring 11 d group were compared with those in blank control group,the differences were not statistically significant(P＞0.05).The result of immunohistochemistry showed:in experiment group,after exposuring immediately and 1 d,expression of CD34 was weak,after exposuring 7 d was strong,after exposuring 14 d was positive;Expression of inducible nitric oxide synthaseafter exposuring immediately was weak,after exposuring 1 d was strong,after exposuring 7,14 d was positive.The results of scanning electron microscopy showed:the inner ear and inner hair cells of animal in the blank control group showed a neatly arranged,inner ear hair cells in after exposuring immediately group and after exposuring 1 d group showed a state of disorder,cochlea second ring visible outer hair cells in after exposuring 7 d group,after exposuring 14 d group showed lack of disorder phenomenon.Conclusion Noise deafness will lead cochlear injury,the number of endothelial progenitor cells will change with the change of time,and it plays an important role in cochlear injury repair.

Noise deafness;Cochlear injury;Endothelial progenitor cells;Changes

R245

A

1673-7210（2015）11（a）-0030-05

2015-06-11本文編輯：蘇 暢）