Caspase-3、TNF-α、bcl-2、bax在人胎兒卵巢中的表達(dá)

王永霞 馬 娜 鐘興明 崔 蓉 王小蘭 楊 寧 苗竹林

1.廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣東廣州 510600；2.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東廣州 510006

Caspase-3、TNF-α、bcl-2、bax在人胎兒卵巢中的表達(dá)

王永霞1馬 娜2▲鐘興明1崔 蓉1王小蘭1楊 寧1苗竹林1

1.廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣東廣州 510600；2.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東廣州 510006

目的 探討人胎兒卵泡的發(fā)育形成過程中卵細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制。方法 收集2013年1～12月廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所妊娠24～32周引產(chǎn)的女性胎兒卵巢組織18例，其中24～27+6周胎兒卵巢8例，28～32周胎兒卵巢10例。采用免疫組織化學(xué)染色法觀察胎兒卵巢卵泡發(fā)育及形成過程中凋亡因子Caspase-3、TNF-α、bcl-2、bax的表達(dá)情況。 結(jié)果Caspase-3表達(dá)在孕中期及孕晚期表達(dá)均為強(qiáng)陽性，TNF-α在卵母細(xì)胞中均表達(dá)，胎兒卵巢內(nèi)的顆粒細(xì)胞及其他間質(zhì)組織細(xì)胞未見陽性表達(dá)。凋亡抑制因子bcl-2的表達(dá)在孕中期及孕晚期均為陰性。促凋亡因子Bax在卵母細(xì)胞及卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)均為陽性表達(dá)。結(jié)論胎兒卵巢發(fā)育過程中，原始卵母細(xì)胞不斷發(fā)生凋亡，由四種凋亡因子同時(shí)共同參與，而bcl-2和bax可能通過活化Caspase-3引起少量顆粒細(xì)胞凋亡。

胎兒卵巢；細(xì)胞凋亡；Caspase-3；腫瘤壞死因子-α；bcl-2；bax

在女性胎兒卵巢的發(fā)育過程中，大部分卵母細(xì)胞在胎兒出生時(shí)已經(jīng)丟失[1]。很多實(shí)驗(yàn)研究證明，哺乳動物的生殖細(xì)胞在其發(fā)生過程中的大量死亡或丟失是細(xì)胞凋亡引起的[2-3]。卵母細(xì)胞發(fā)生過程中的細(xì)胞凋亡是一個(gè)繁雜的過程，涉及的基因很多，目前發(fā)現(xiàn)的主要為促細(xì)胞凋亡基因、抑制細(xì)胞凋亡基因和在細(xì)胞凋亡過程中有協(xié)助作用的基因。細(xì)胞凋亡是各種因子相互協(xié)調(diào)、許多通路交互作用的過程。但到目前為止對于人胎兒卵巢發(fā)育的研究比較少，其發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生及其機(jī)制方面的研究也很少，凋亡基因及凋亡因子在卵母細(xì)胞內(nèi)定位及其相互作用機(jī)制也未完全闡明，調(diào)控卵母細(xì)胞凋亡的途徑也不清楚。因此，本研究采用免疫組化法檢測參與細(xì)胞凋亡兩種途徑的重要因子Caspase-3、TNF-α、bcl-2、bax在人胎兒卵巢組織中的表達(dá)，旨在探討胎兒卵巢發(fā)育過程中卵母細(xì)胞的凋亡及其調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究女性生殖細(xì)胞凋亡及其調(diào)控提供可靠依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2013年1～12月廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所（以下簡稱“本研究所”）由于母親或社會因素行妊娠終止的病例，用米非司酮加前列腺素的方法行中期妊娠引產(chǎn)。收集妊娠24～32周引產(chǎn)的女性胎兒卵巢組織18例。其中孕中期（24～27+6周）胎兒卵巢8例，孕晚期（28～32周）胎兒卵巢10例。本研究人胎兒卵巢組織的收集及研究方案均得到本研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會討論通過，收集的胎兒卵巢組織必須得到胎兒母親的同意，且均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織處理 卵巢組織投入10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋，最終切成3 μm石蠟切片。

1.2.2 主要試劑 bcl-2、Caspase-3抗體由北京中杉金橋公司提供；bax、TNF-α抗體由武漢博士德公司提供。

1.2.3 免疫組化 SP法檢測 Caspase-3、TNF-α、bcl-2、bax的表達(dá) 主要染色步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。以已知陽性切片為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照?？乖迯?fù)使用高壓修復(fù)，時(shí)間為12 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。

1.2.4 陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn) 對全片多個(gè)區(qū)域均染色強(qiáng)度較低的病例，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行評分，對全片染色強(qiáng)度較高病例，則隨機(jī)選取1個(gè)視野進(jìn)行評分。要求顯微下每個(gè)20倍視野至少有200個(gè)可用于評價(jià)的細(xì)胞。分析每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)的平均數(shù)作為該切片的陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分：0%～5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度以多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特征為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。二者相加，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中等陽性（++），6～7分為強(qiáng)陽性（+++）。其中（-）和（+）記為低表達(dá)，（++）和（+++）記為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 Caspase-3在胎兒卵巢組織中的表達(dá)

Caspase-3陽性細(xì)胞主要定位于卵細(xì)胞的細(xì)胞漿，也可見細(xì)胞核著色，呈棕黃色或棕褐色。Caspase-3在卵細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，胎兒卵巢內(nèi)的顆粒細(xì)胞也呈陽性表達(dá)。其表達(dá)在孕中期及孕晚期均為強(qiáng)陽性。見圖1。

圖1 Caspase-3在孕中期、孕晚期胎兒卵巢組織中的表達(dá)（SP法，400×）

2.2 TNF-α在胎兒卵巢組織中的表達(dá)

TNF-α陽性細(xì)胞主要定位于卵細(xì)胞的細(xì)胞漿，細(xì)胞核未見著色，呈棕黃色。TNF-α在卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，胎兒卵巢內(nèi)的顆粒細(xì)胞及其他間質(zhì)組織細(xì)胞未見陽性表達(dá)。孕中期卵母細(xì)胞較多，孕中期表達(dá)高于孕晚期。見表1、圖2。

表1 Caspase-3、TNF-α在胎兒卵巢卵母細(xì)胞中的表達(dá)（例）

圖2 TNF-a在孕中期、孕晚期胎兒卵巢組織中的表達(dá)（SP法，400×）

2.3 bcl-2在胎兒卵巢組織中的表達(dá)

bcl-2陽性細(xì)胞主要定位于細(xì)胞核，呈棕褐色。bcl-2在孕中期及孕晚期卵母細(xì)胞內(nèi)均未見表達(dá)，僅少部分孕中期胎兒卵巢內(nèi)的顆粒細(xì)胞可見少許陽性表達(dá)。見圖3。

圖3 Bcl-2在孕中期、孕晚期胎兒卵巢組織中的表達(dá)（SP法，400×）

2.4 bax在胎兒卵巢組織中的表達(dá)

Bax陽性細(xì)胞主要定位于卵細(xì)胞的細(xì)胞核，也可見卵母細(xì)胞胞漿著色，呈棕黃色或棕褐色。Bax在卵母細(xì)胞及卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)均為陽性表達(dá)，在卵母細(xì)胞中，其表達(dá)在孕中期明顯高于孕晚期，在顆粒細(xì)胞中，孕中期與孕晚期的表達(dá)均為陽性。見表2、圖4。

表2 bcl-2、bax在胎兒卵巢卵母細(xì)胞中的表達(dá)（例）

圖4 Bax在孕中期、孕晚期胎兒卵巢組織中的表達(dá)（SP法，400×）

3 討論

胎兒卵巢發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞在其形成過程中會大量死亡或丟失[1-4]。女性卵母細(xì)胞儲備量一出生就已確定，在女性一生中僅有極少量的卵母細(xì)胞生長、排卵、受精，大多數(shù)卵母細(xì)胞走向閉鎖退化，婦女在其成年期大約可以排出400個(gè)卵母細(xì)胞[5-6]，出生時(shí)原始卵泡數(shù)量的多少決定了卵巢的儲備功能，是維持女性生殖功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，目前對于胎兒卵巢發(fā)育過程中卵母細(xì)胞丟失的具體機(jī)制尚不清楚。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在卵母細(xì)胞的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[7]。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是由體內(nèi)外某些因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞主動性死亡。研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡主要有兩種途徑：胞外信號途徑和胞內(nèi)信號途徑[8]。胞外信號途徑的特點(diǎn)是通過Fas抗原、TNF-α及TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體介導(dǎo)（TRAIL），激活下游的Caspases（Caspase-3），導(dǎo)致細(xì)胞死亡。胞內(nèi)信號途徑是通過使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿而引起凋亡，受bcl-2家族蛋白的調(diào)控至今，哺乳動物中已經(jīng)鑒定出15種bcl-2家族蛋白。bcl-2相關(guān)蛋白分為兩類：一類具有抗調(diào)亡功能，如bcl-2和bcl-XL；另一類具有促凋亡作用，如bax、Bak。兩種途徑最后都活化Caspase-3，再通過Caspase-3的底物肌動蛋白和多聚核糖多聚酶（PARP）使DNA裂解，導(dǎo)致細(xì)胞不可逆凋亡。Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的主要誘導(dǎo)者[9]，bax和bcl-2的關(guān)系決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[10]。

本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法，在24～32周胎兒卵巢組織中，同時(shí)標(biāo)記Caspase-3、TNF-α、bcl-2、bax兩種途徑的細(xì)胞凋亡因子。結(jié)果顯示，Caspase-3在胎兒卵巢內(nèi)的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均為陽性表達(dá)。且在孕中期（24～27+6周）及孕晚期（28～32周）中的表達(dá)均為強(qiáng)陽性。TNF-α在卵母細(xì)胞中均表達(dá)陽性，而在胎兒卵巢內(nèi)的顆粒細(xì)胞及其他間質(zhì)組織細(xì)胞的表達(dá)均為陰性。孕中期卵母細(xì)胞數(shù)量較多，孕中期卵母細(xì)胞的凋亡及TNF-α的表達(dá)則明顯高于孕晚期。而顆粒細(xì)胞的凋亡另有不同。Bcl-2在孕中期及孕晚期卵母細(xì)胞中的表達(dá)均為陰性。而bax在卵母細(xì)胞及卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)均為陽性表達(dá)，在卵母細(xì)胞中，其表達(dá)在孕中期明顯高于孕晚期，在顆粒細(xì)胞中，孕中期與孕晚期的表達(dá)均為陽性，因此，綜合目前研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測出，胎兒卵巢中卵母細(xì)胞的凋亡，可以通過兩種調(diào)控細(xì)胞凋亡的途徑同時(shí)進(jìn)行，多種凋亡調(diào)控因子均在卵母細(xì)胞中表達(dá)，抑制凋亡因子bcl-2的陰性表達(dá)更能印證這一點(diǎn)。而胎兒卵巢中顆粒細(xì)胞的凋亡則主要由bax和bcl-2協(xié)同調(diào)控完成的。TNF-α在胎兒卵巢顆粒細(xì)胞中均為陰性表達(dá)，Caspase-3在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均陽性表達(dá)。說明bax和bcl-2的作用也可能是通過活化Caspase-3來促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[11]。同時(shí)，也印證了這四種蛋白因子與胎兒卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的凋亡有著密切的關(guān)系。

細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是Caspase家族蛋白酶，其中Caspase-3是其中最重要的細(xì)胞凋亡效應(yīng)蛋白，參與多種不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。國外有研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3在黃體顆粒細(xì)胞中表達(dá)，并參與黃體萎縮過程中顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控[12]。同時(shí)，李忠香等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)Caspase-3在胎兒卵母細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而且與卵母細(xì)胞的凋亡呈正相關(guān)，提示Caspase-3可能參與卵母細(xì)胞凋亡及其調(diào)控過程。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)TNF-α在胎兒卵巢卵母細(xì)胞中也表達(dá)，TNF-α屬于TNF家族，可以激活Caspase蛋白酶、JNK和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB三條信號通路，實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞毒性、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能。提示這也可能是胎兒卵巢中卵母細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。

bcl-2與bax共屬于一個(gè)家族，通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)凋亡激活物。bax二聚體可以在線粒體膜上打開通道，提高其通透性，bcl-2與bax形成異聚體，從而降低線粒體膜的通透性。bax屬于促凋亡因子，而bcl-2則屬于抑制凋亡因子。本研究結(jié)果顯示，在胎兒卵巢組織卵母細(xì)胞中bax呈高表達(dá)，而bcl-2則呈低表達(dá)或者不表達(dá)，這說明胎兒卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在卵巢發(fā)育過程中大量凋亡，其機(jī)制可能由這兩種細(xì)胞因子共同協(xié)調(diào)作用完成的。綜上所述，細(xì)胞凋亡是胎兒卵巢細(xì)胞發(fā)育過程中重要的過程，也是通過各種凋亡因子的相互作用共同完成凋亡過程。

卵巢發(fā)育過程中卵細(xì)胞的凋亡不僅僅決定了女性出生時(shí)所具備的卵母細(xì)胞儲備量大小，也同時(shí)與出生后卵母細(xì)胞從卵巢中丟失的速度密切相關(guān)。在不同時(shí)期的卵泡發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞的凋亡也不盡相同，在早期卵泡閉鎖時(shí)，卵母細(xì)胞首先發(fā)生凋亡，而顆粒細(xì)胞則由內(nèi)向外逐漸凋亡；而晚期的卵泡閉鎖時(shí)，顆粒細(xì)胞首先發(fā)生凋亡，從而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡，觸發(fā)了卵泡閉鎖[14-15]。卵巢中卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的凋亡還與多種疾病密切相關(guān)，多項(xiàng)研究證實(shí)，多囊卵巢綜合征的病因與病理機(jī)制與卵巢中顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控異常密切相關(guān)[16-17]。卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的凋亡不僅是引起卵泡閉鎖的原因，而且與卵巢正?；虍惓５墓δ芟嚓P(guān)[18-20]。卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡也是卵巢早衰發(fā)病的主要原因之一[21-22]。

卵母細(xì)胞儲備量與生俱來，無法改變，不孕不育問題已經(jīng)成為一個(gè)社會性問題。因此，如何提高女性生育能力，延長女性生育年限，保持女性卵巢功能已經(jīng)成為刻不容緩的問題，研究卵巢卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制，對于解決這個(gè)問題有重要意義。尤其是對胎兒卵巢發(fā)育過程中卵泡凋亡及其機(jī)制的研究，可以幫助我們更好地了解卵母細(xì)胞發(fā)育過程及機(jī)制，對于開發(fā)和利用卵巢內(nèi)卵泡資源有重要意義。同時(shí)為輔助生育技術(shù)和女性生殖系統(tǒng)疾病的治療提供研究基礎(chǔ)，有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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ExPression of the CasPase-3,TNF-α,bcl-2 and bax in the fetal ovarian

WANG Yongxia1MA Na2▲ZHONG Xingming1CUI Rong1WANG Xiaolan1YANG Ning1MIAO Zhulin1

1.Guangdong Family Planning Research Institute,Guangdong Province,Guangzhou 510600,China;2.Department of Physiology,Basic School of Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Province,Guangzhou 510006,China

Objective To investigate the apoptosis and the expression of apoptosis related protein Caspase-3,TNF-α, bcl-2,bax of the oocyte during human fetal development.Methods Ovarian tissues from 18 fetuses(aged from 24 to 32 weeks)were obtained after labortion induced by mifepristone and PG from January to December 2013 in Guangdong Family Planning Research Institute,including 8 fetuses of midpregnancy (aged 24-27+6weeks)and 10 fetuses of latepregnancy (aged 28-32 weeks).The morphology and development of oocyte were observed using HE-staining and immunohistochemistry.The expression of the apoptosis related protein，such as Caspase-3,TNF-α,bcl-2,bax of the oocyte during human fetal follicular development were examined.Results The Caspase-3 was positive both in the fetal oocytes and the granulosa cells.TNF-α was positive in the oocytes.Bcl-2 was negative both in the fetal oocytes and the granulosa cells.Bax was positive both in the fetal oocytes and the granulosa cells.Conclusion The four apoptosis factors are all participate in the oocyte apoptosis during human fetal development.bcl-2 and bax may result in the granulosa cells apoptosis participate through activate the Caspase-3.

Fetal ovarian;Apoptosis;Caspase-3;TNF-α;bcl-2;bax

R339.22

A

1673-7210（2015）11（a）-0021-04

2015-06-25本文編輯：任 念）

廣東省人口和計(jì)生委科研課題項(xiàng)目（20110202）?！?/p>