龜鹿二仙膠含藥血清誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制

牛素生 李 楠 張 燕 劉俊寧 林建華

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，福建福州 350122；2.福建醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，福建福州 350005

龜鹿二仙膠含藥血清誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制

牛素生1李 楠1張 燕1劉俊寧1林建華2

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，福建福州 350122；2.福建醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，福建福州 350005

目的觀察龜鹿二仙膠含藥血清誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化的作用并探討其機(jī)制。方法全骨髓貼壁法分離BMSCs，培養(yǎng)至F3代。MTT法檢測(cè)龜鹿二仙膠含藥血清增殖作用并確定最佳濃度；F3細(xì)胞分為10%FBS組、10%KB組、10%GLEXJ組和Classical組，檢測(cè)堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）比活性，茜素紅染色方法觀察對(duì)BMSCs成骨分化的作用，RT-PCR方法和Western blot檢測(cè)Fzd-2、Axin-2基因和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果MTT結(jié)果顯示濃度為10%的龜鹿二仙膠含藥血清能促進(jìn)BMSCs增殖；10%GLEXJ組和Classical組ALP比活性高于其余兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，增加更明顯（P＜0.05或P＜0.01），茜素紅染色見橘紅色鈣結(jié)節(jié)著色；10%GLEXJ組Fzd-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05或P＜0.01）；10%GLEXJ組Axin-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于10%FBS組和10% KB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論龜鹿二仙膠含藥血清能促進(jìn)BMSCs增殖并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，其機(jī)制可能與增強(qiáng)Fzd-2表達(dá)、抑制Axin-2表達(dá)和激活Wnt/β-catenin通路密切相關(guān)。

龜鹿二仙膠；骨質(zhì)疏松癥；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化

骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和容易導(dǎo)致骨折為特征的全身骨代謝疾病。近年來(lái)，中醫(yī)藥越來(lái)越多應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的防治。龜鹿二仙膠出自《醫(yī)方考·虛損勞瘵門》，臨床常用于骨質(zhì)疏松癥的治療[1-2]，且無(wú)毒副作用[3]。前期研究表明龜鹿二仙膠能增加去卵巢大鼠骨密度和骨強(qiáng)度[4-5]，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向成骨細(xì)胞分化的作用并探求其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠65只，其中3月齡60只，體重255～290 g，1月齡5只，體重90～95 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）：2007-0005；合格證號(hào)：2007000532861]。

1.1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型；美國(guó)Thermo公司）、超微量蛋白核酸酶分析儀（ND-2000C型；美國(guó)Thermo公司）、倒置顯微鏡（Olympus IX70；日本Olympus株式會(huì)社）、多用電泳儀（DYY-12型；美國(guó)Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（GEL DOC2000；美國(guó)Bio-Rad公司）、PCR儀（S1000型；美國(guó)Bio-Rad公司）、PVDF膜（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.1.3 主要試劑 LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；SD大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購(gòu)于廣州賽業(yè)生物科技有限公司；茜素紅-S粉購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Axin-2、Fzd-2和β-actin兔抗大鼠單克隆蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司；BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)藥物 龜鹿二仙膠由鹿角膠6 g、龜甲9 g、枸杞子9 g、人參6 g組成，藥材選用培力藥業(yè)有限公司“農(nóng)本方”濃縮中藥配方顆粒，各藥物濃縮比例及人與大鼠體表面積換算[6]后的等效劑量見表1。

表1 龜鹿二仙膠藥物組成及劑量

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龜鹿二仙膠含藥血清制備 60只3月齡大鼠從腹腔入路切除雙側(cè)卵巢，分為A、B兩組，各30只。術(shù)后第二天開始8∶00 am和2∶00 pm灌胃，A組灌服人等效劑量的龜鹿二仙膠[1080 mg/（kg·d）]，B組灌服等容積生理鹽水，連續(xù)7 d。最后一次灌胃2 h后腹主動(dòng)脈取血，1000 r/min離心15 min后取上層血清并將同組血清混合，56℃水浴滅活，0.22 μm濾器過濾后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BMSCs分離及培養(yǎng) 1月齡SD大鼠斷頸法處死后，75%乙醇浸泡5 min，游離股骨和脛骨并顯露骨髓腔，用含10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，200目濾網(wǎng)過濾沖洗液，置于CO2培養(yǎng)箱，記為F1。48 h后首次全量換液，后每2天換液，至細(xì)胞融合80%～90%時(shí)傳代。首次傳代時(shí)，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個(gè)/瓶傳至25 mL培養(yǎng)瓶，后每2天換液，至融合80%～90%時(shí)1∶4比例傳代，至F3代。

1.2.3 BMSCs形態(tài)觀察 自F1代開始，倒置顯微鏡每天觀察BMSCs生長(zhǎng)情況。

1.2.4 MTT法檢測(cè)龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)BMSCs增殖影響 F3代細(xì)胞以4×103個(gè)/孔密度傳至96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組及干預(yù)條件，見表2。細(xì)胞貼壁后血清饑餓24 h，加入相應(yīng)條件培養(yǎng)基1 d后，每組取8孔，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT液，37℃孵育4 h，吸除殘余MTT液，每孔加入100 μL的DMSO溶解淡藍(lán)色結(jié)晶，570 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，連測(cè)8 d，觀察龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響并選擇促進(jìn)增殖作用最明顯的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 F3代細(xì)胞分組及干預(yù)條件

1.2.5 龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)BMSCs成骨分化的影響 F3代細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，將細(xì)胞分為10%FBS（LG-DMEM+10%胎牛血清）組、10% KB（LG-DMEM+10%大鼠空白血清）組、10%GLEXJ（LG-DMEM+10%龜鹿二仙膠含藥血清）組和Classical [LG-DMEM+10%胎牛血清+地塞米松（1×10-8mol/L）+ β-甘油磷酸鈉（10 mmol/L）+維生素C（50 mg/L）]組。饑餓24 h后更換條件培養(yǎng)基，每2天全量換液。

1.2.6 堿性磷酸酶（ALP）比活性檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)第7、14、21天后，比色法測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液ALP活性。按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)各管吸光度值，計(jì)算各測(cè)試管ALP活性。另用紫外分光光度計(jì)以595 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，測(cè)定蛋白濃度（mg/L），ALP比活性（U/mg）=ALP濃度/總蛋白濃度。

1.2.7 BMSCs鈣結(jié)節(jié)染色 誘導(dǎo)21 d后，PBS洗滌細(xì)胞，10%福爾馬林固定45 min，蒸餾水緩慢沖洗2遍，晾干后每孔加入新鮮配制的茜素紅-S染液（pH=4.2）1 mL，37℃遮光孵育30 min，蒸餾水反復(fù)沖洗，干燥后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 RT-PCR法檢測(cè)Fzd-2和Axin-2基因的表達(dá) 誘導(dǎo)21 d后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度后取總RNA 1 μg，用Revert Aid TM cDNA第一鏈合成試劑盒，20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA為PCR模板。PCR反應(yīng)體系為20 μL，由Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）10 μL、nuclease-free Water 8.2 μL、前后引物各0.4 μL和cDNA 1 μL組成。上海生工生物工程有限公司合成引物，見表3。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火，72℃延伸45 s，完成各自循環(huán)后，72℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL行瓊脂糖凝膠電泳20 min，以Image Lab 3.0軟件分析圖像，以目的條帶和內(nèi)參GAPDH的灰度值比值進(jìn)行分析。

表3 引物及反應(yīng)條件

1.2.9 Western blot法檢測(cè)Fzd-2和Axin-2蛋白的表達(dá) 誘導(dǎo)21 d后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。蛋白變性每孔取20 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳，TBST液洗滌后室溫封閉1 h，加入稀釋后的兔抗大鼠Fzd-2（1∶200）、Axin-2（1∶1000）、β-actin（1∶1000）一抗，4℃搖床過夜后濕式轉(zhuǎn)膜，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌后將PVDF膜置于顯影墊片，在PVCF膜蛋白面滴加顯影液，1 min后顯影。美國(guó)UVP分析儀對(duì)膠片掃描，目標(biāo)蛋白灰度值與β-actin灰度值之比作為目的蛋白表達(dá)水平的相對(duì)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

3～4 d后可見少許細(xì)胞貼壁，呈細(xì)長(zhǎng)外形，部分有突起。6～8 d后，細(xì)胞簇狀生長(zhǎng)，10 d左右細(xì)胞形態(tài)均一，按一定方向緊密排列，呈典型旋渦狀。傳代細(xì)胞增殖快，每5～6天即可鋪滿瓶底。至F3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)一致，均勻貼壁于瓶底。見圖1。

圖1 F1代培養(yǎng)8 d（200×）

2.2 龜鹿二仙膠含藥血清促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化

2.2.1 MTT結(jié)果 除DMEM組外，其余各組OD值自第2天起即顯著增高，其中10%的GLEXJ組增高明顯，顯著高于其余各組，說(shuō)明10%濃度的龜鹿二仙膠含藥能促進(jìn)BMSCs增殖。見圖2。

圖2 龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)BMSCs增殖作用

2.2.2 ALP比活性的比較 各組細(xì)胞ALP比活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高，且10%的GLEXJ組和Classical組顯著高于10%的KB組和10%的FBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，該兩組細(xì)胞培養(yǎng)液ALP比活性增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），但10%GLEXJ組ALP比活性與Classical比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.2.3 鈣結(jié)節(jié)染色 10%FBS組和10%KB組細(xì)胞因互相重疊致形態(tài)不規(guī)則，茜素紅染色未見鈣結(jié)節(jié)形成。10%GLEXJ組和Classical組細(xì)胞密度大，梭形外觀不明顯，細(xì)胞重疊，形狀、排列極不規(guī)則，呈明顯的團(tuán)簇樣聚集，茜素紅染色可見數(shù)個(gè)明顯的橘紅色鈣結(jié)節(jié)著色（白色箭頭）。見圖4（封三）。

圖3 龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)ALP比活性的影響

2.3 Fzd-2和Axin-2 mRNA的表達(dá) 10%GLEXJ組Fzd-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于10%FBS組、10%KB組和Classical組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），而10%KB組、10%FBS組和Classical組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。10%GLEXJ組Axin-2 mRNA的表達(dá)水平顯著低于10%FBS組、10%KB組和Classical組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)Fzd-2和Axin-2 mRNA表達(dá)的影響

2.4 Fzd-2和Axin-2蛋白表達(dá) 10%GLEXJ組Fzd-2蛋白表達(dá)顯著高于10%FBS組、10%KB組和Classical組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而10% FBS組、10%KB組和Classical組間無(wú)顯著性差異；10%GLEXJ組和Classical組Axin-2蛋白水平顯著低于10%FBS組和10%KB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；10%GLEXJ組Axin-2蛋白表達(dá)水平顯著高于Classical組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 龜鹿二仙膠含藥血清對(duì)Fzd-2和Axin-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”，腎精和骨之間關(guān)系密切。女性絕經(jīng)后腎中精氣衰微致使骨骼失去濡養(yǎng)引起“骨痿不能起于床”、“腰脊不舉”等[7-8]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中骨質(zhì)疏松癥臨床表現(xiàn)相似[9-10]，而骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與BMSCs關(guān)系密切。研究表明“補(bǔ)腎”中藥具有“壯骨”功能，推測(cè)其與促進(jìn)BMSCs增殖[11]作用相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示濃度為10%的龜鹿二仙膠含藥血清具有促進(jìn)BMSCs增殖的作用，說(shuō)明龜鹿二仙膠增加骨密度的作用與其增強(qiáng)BMSCs增殖有關(guān)。

同時(shí)，BMSCs可在體內(nèi)某些因素的作用下向成骨細(xì)胞分化，并參與和維持骨的構(gòu)建過程[12-13]?！把a(bǔ)腎”中藥除了能促進(jìn)BMSCs增殖外，還能誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化[1-2]。本研究結(jié)果顯示龜鹿二仙膠含藥血清組ALP比活性顯著增高，茜素紅染色可見橘紅色鈣結(jié)節(jié)形成，表明龜鹿二仙膠含藥血清能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。而在BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中，受多條信號(hào)通路[14-16]的調(diào)控。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化方式促進(jìn)骨形成[17]，且中藥可通過對(duì)該通路相關(guān)因子基因和蛋白的表達(dá)的影響參與BMSCs成骨分化的過程[18-19]。在Wnt/βcatenin信號(hào)通路中，F(xiàn)zd是一種跨膜蛋白，與通路的激活密切相關(guān)，而Axin-2與BMSCs成骨分化關(guān)系密切，敲除Axin-2基因能增加骨祖細(xì)胞、增加成骨標(biāo)志物表達(dá)并能加速骨化[20]。本實(shí)驗(yàn)中龜鹿二仙膠含藥血清誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中，F(xiàn)zd-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，而Axin-2活性受到顯著的抑制。所以，龜鹿二仙膠可通過調(diào)控Fzd-2和Axin-2的活性激活Wnt/β-cateinin信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

綜上所述，龜鹿二仙膠含藥血清能促進(jìn)BMSCs增殖，同時(shí)可通過調(diào)控Fzd-2和Axin-2的活性激活Wnt/β-cateinin信號(hào)通路誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，但由于Wnt信號(hào)通路的組成復(fù)雜，其機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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Effects and mechanisms for Guilu Erxian Glue-containing serum on the osteogenic differentiation of BMSCs

NIU Susheng1LI Nan1ZHANG Yan1LIU Junning1LIN Jianhua2

1.School of Orthopedics and Traumatology,Fujian University of TCM,Fujian Province,Fuzhou 350122,China;2.Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fujian Province,Fuzhou 350005, China

Objective To observe the effect of the Guilu Erxian Glue(GLEXJ)containing serum on the proliferation and the osteogenic differentiation of BMSCs,and try to reveal the mechanism.Methods The BMSCs were isolated by the adherent cell cytopheresis and were expanded to the F3generation,MTT method was used to observe the effects of GLEXJ-containing serum on the proliferation of BMSCs.Then cells were separated to 4 groups,10%FBS group,10%KB group,10%GLEXJ group and Classical group.The ALP activity and the Alizarin Red staining were used to define the osteogenic differentiation of BMSCs.And the mRNA and protein expression of Fzd-2 and Axin-2 were detected by RT-PCR and Western blot method.Results The results of MTT showed that the 10%concentration of GLEXJ-containing serum can stimulate the proliferation of BMSCs.The ALP activity of 10%GLEXJ and Classical group were higher than the other two groups(P＜0.05),and the level was gradually increased in a time-dependent manner(P＜0.05 or P＜0.01);the calcium nodules of orange-red color were observed in the GLEXJ-containing serum group and the Classical group in ARS。The mRNA and protein expression of Fzd-2 in 10%GLEXJ group were higher than the other groups(P＜0.05 or P＜0.01);the mRNA and protein expression of Axin-2 in 10%GLEXJ group were lower than the 10%FBS group and the 10%KB group(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion The GLEXJ-containing serum can enhance the prolif-eration and the osteogenic differentiation of BMSCs,the possible mechanism is by stimulating the Fzd-2 expression and inhibiting the Axin-2 expression which related with the activity of Wnt/β-catenin pathway.

Guilu Erxian Glue;Osteoporosis;Bone mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation

R285.5

A

1673-7210（2015）11（a）-0008-05

2015-07-12本文編輯：關(guān) 婧）

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01382）。

牛素生（1979.7-），男，碩士；研究方向：中醫(yī)骨傷科學(xué)。

林建華（1955.9-），男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師；研究方向：代謝性骨疾病基礎(chǔ)與臨床。