哮喘血清誘導氣道上皮細胞中MAL的表達及柴樸湯干預的影響

劉 鑫，夏 之，羅曉青，熊 花

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，湖南 衡陽421001；2.南華大學第一臨床學院，湖南 衡陽421001；3.益陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 益陽413000）

支氣管哮喘是一種臨床上較為常見的疾病，其發(fā)病機制尚不完全清楚。 目前研究表明，支氣管哮喘的病變主要是以氣道慢性炎癥、 氣道高反應性及氣道重塑為主，其中，氣道重塑與哮喘癥狀的嚴重性、臨床療效及預后有密切關(guān)系[1]。 氣道上皮細胞的增殖以及纖維化是氣道重塑的重要組成部分， 而T 細胞成熟相關(guān)蛋白 （T-lymphocyte maturation associated protein T，MAL）有著維持上皮細胞穩(wěn)定性的作用，研究表明，MAL 隨著大鼠哮喘病程的進展，表達動態(tài)下調(diào)[2]。 明代王肯堂《證治準繩》的柴樸湯，由小柴胡湯和半夏厚樸湯組成，有行氣、化痰、平喘的作用。 本研究旨在探討柴樸湯對哮喘氣道上皮細胞中MAL 表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD 大鼠64 只（南華大學動物部提供），體質(zhì)量(250±10) g。 動物許可證號：scxk （湘）2009-0012， 飼養(yǎng)室溫維持在18～22 ℃之間， 相對濕度40%～70%， 飼養(yǎng)環(huán)境合格證號：scxk（湘）2009-0010，按標準化飼養(yǎng)，喂全價營養(yǎng)飼料，每日2～3 次按時喂養(yǎng)，每天更換飲用水源。

1.1.2 主要試劑 卵蛋白(OVA，美國Sigma 公司，批號：120602)；氫氧化鋁粉末（天津生化試劑廠，批號：120802）；小鼠MAL 抗體（博士德生物技術(shù)有限公司，批號：20120818）；SABC 免疫組化試劑盒 （博奧森生物技術(shù)有限公司， 批號：20120713）；DAB 顯色試劑盒 （博奧森生物技術(shù)有限公司， 批號：20120728）；MAL PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號：E·129911，上游引物：5-CAG AGC AAT TAA CTG GTC AGC CT-3， 下游引物：5-GGA AGT TAA ATT CAG CAA GCC CT-3]；RNA 提取試劑盒 （東盛生物技術(shù)有限公司， 批號：00073758）；RNA 樣本保存液 （天根生物， 批號：00084763）。

1.1.3 試藥 中藥柴樸湯：由柴胡、半夏、茯苓、黃芩、厚樸、大棗、白參、甘草、蘇葉、生姜中藥配方顆粒組成，按7∶5∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶2∶1 比例配制，由一方制藥有限公司提供，批號：406170t。 1 g 顆粒劑相當于生藥6.8 g，用蒸餾水沖泡，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 主要儀器 多功能超聲霧化器（鞍山電子醫(yī)療儀器廠，YZB/遼0390-2006 JSC 型）；PCR 儀（美國biometra，HBPX2）； 輪轉(zhuǎn)式切片機 （德國來卡公司，RM2245）；凝膠成像分析系統(tǒng)（英國UVP 公司，BioSpectrum 410）； 紫外分光光度儀 （日本島津公司，UV-1206 型分光光度儀）；電泳儀（北京市六一儀器廠，DYY-7C 型）；光學顯微鏡（o1ympus 公司，SZ61）。

1.1.5 實驗細胞 由中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所提供大鼠氣道上皮細胞， 資源編號：3111C0001CCC000149。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及含藥血清制備 隨機從64 只健康雄性SD 大鼠中抽取32 只分為4 組， 即正常組8只，柴樸湯高劑量組8 只（高劑量組）、中劑量組8只（中劑量組）、低劑量組8 只（低劑量組），生理鹽水組8 只（正常組）。 剩余為模型組32 只。 柴樸湯高、中、低劑量組按體表面積[3]折算后，每日給藥提取物量分別為3.00、1.50、0.75 g/kg、 正常組給予等體積生理鹽水，每日2 次，連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥1 h 后，乙醚麻醉，無菌條件下，經(jīng)心臟采血，每只大白鼠約采集5 mL 血液，冷置1 h，4 ℃，2 500 r/min 離心25 min， 分離得0.5 mL 血清，于56 ℃溫育30 min 滅活，每組8 份血清混合，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?所取血清分別為柴樸湯高、中、低劑量組、正常組。

1.2.2 哮喘血清大鼠模型建立[4]及大鼠哮喘血清的采集 模型組在第1 天和第8 天腹腔注射卵蛋白[Albumin（egg white），OVA]1 mg+氫氧化鋁200 mg+生理鹽水1 mL 混懸液分別在大鼠兩腹股溝、腹部、前足趾4個部位皮下注射，每處0.2 mL，同時腹腔注射0.2 mL 致敏，第15 天時以1%OVA 霧化激發(fā)，每次激發(fā)時間30 min，隔天1 次，共8 周?？乖ぐl(fā)后，以大鼠出現(xiàn)呼吸加深加快、呼吸困難、腹肌收縮、行動緩慢呆滯、精神萎靡等為激發(fā)成功標志，代表哮喘模型復制成功。 末次激發(fā)后，用乙醚麻醉大鼠無菌條件下心臟采血， 每只大白鼠約采集5 mL血液，冷置1 h，離心(4 ℃，2 500 r/min，25 min)，分離約0.5 mL 血清，于56 ℃溫育30 min 滅活，共32份血清混合，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?所取血清為大鼠哮喘血清。

1.2.3 大鼠氣道上皮細胞的培養(yǎng) 將大鼠氣道上皮細胞以DMEM 完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，置37 ℃、體積分數(shù)5% CO2中培養(yǎng)，隔天換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長至生長基質(zhì)的70%～80%表面積，予以傳代培養(yǎng)。

1.2.4 分組及細胞誘導 取傳代的第20 代生長良好的大鼠氣道上皮細胞分為：正常血清組、柴樸湯高劑量血清+哮喘血清（下稱柴哮高組）、柴樸湯中劑量血清+哮喘血清（下稱柴哮中組）、柴樸湯低劑量血清+哮喘血清（下稱柴哮低組）、正常血清+哮喘血清（下稱鹽哮血清）、哮喘血清。 每組樣本數(shù)為5，各血清總濃度均為20%，其中柴哮高、中、低組、鹽哮血清各血清濃度為10%，混合后為20%[4]，各組培養(yǎng)基量相等。 培養(yǎng)24 h，棄細胞培養(yǎng)液，收集細胞。

1.3 指標檢測

1.3.1 肺組織標本留取及組織形態(tài)學觀察 取血后留取模型組及正常組大鼠，充分暴露胸腔，左肺上葉注入4%的多聚甲醛5 mL， 取下后置于4%的多聚甲醛溶液中保存固定1 周， 取固定的肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察切片肺臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 各組氣道上皮細胞中MAL mRNA 檢測 用半定量RT-PCR 檢測氣道上皮細胞中MAL 信使核糖核酸（Messenger RNA，mRNA）的表達，按東盛生物技術(shù)有限公司提供試劑盒操作方法進行。 取實驗上皮細胞，經(jīng)研磨、裂解、沉淀、洗滌、離心等處理后， 溶解于DEPC 處理水中。 用紫外分光光度計測A260/A280 的比值（OD 值）在1.8～2.0 之間，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察28S 與18S 條帶清晰且密度比值約等于2，表明RNA 樣品無污染，可用。根據(jù)基因庫基因序列設計引物序列，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增引物如下：上游引物：5-CAG AGC AAT TAA CTG GTC AGC CT-3，下游引物：5-GGA AGT TAA ATT CAG CAA GCC CT-3，產(chǎn)物擴增長度：185 bp。 預變性94 ℃5 min，變性94 ℃60 s，退火54 ℃50 s，延伸72 ℃50 s，共30個循環(huán)， 終末延伸72 ℃7 min， 肌動蛋白[（β-non-muscle actin，β-actin) 上游引物：5-TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA T-3，下游引物：5-AAA GAA AGG GTG TAA AAC GCA-3， 產(chǎn)物擴增長度：432 bp]也按以上程序一起擴增。 循環(huán)后PCR 擴增產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖電泳分離，Image-Tool 2.0 分析各組電泳條帶灰度積分，以β-actin 的灰度積分作為標準校正各組MAL 電泳條帶灰度積分，得出MAL 的相對灰度值，進行半定量分析。

1.3.3 各組氣道上皮細胞中MAL 蛋白的檢測 用免疫組化檢測氣道上皮細胞中MAL 蛋白的表達，按博奧森生物技術(shù)有限公司提供試劑盒操作方法進行。 常規(guī)10%甲醛固定30 min，脫蠟、水化。 用磷酸鹽生理鹽水緩沖液（PBS）（0.01 M）沖洗3 次，每次3 min； 細胞抗原加熱修復： 煮沸2 次后PBS 洗5 min； 過氧化酶阻斷劑封閉 15 min，PBS 沖洗，3 min×3 次；滴加5%BSA 封閉液，室溫20 min；滴加稀釋為1∶330 的MAL 抗， 室溫下過夜，PBS 沖洗3 min×3 次； 滴加二抗孵育10 min 后，PBS 沖洗3 min×3 次；水沖洗，蘇木素復染；DAB 顯色：室溫顯色3～10 min；脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封片、光學顯微鏡觀察。 陽性信號為胞質(zhì)或胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒。 采集圖像后，以Image-pro plus 5.1 圖像分析軟件系統(tǒng)， 測定陽性顆粒的平均光密度（average optical density，AOD）， 計算其平均值， 代表MAL 蛋白表達的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以“±s”表示，方差齊者用方差分析，方差不齊用秩和檢驗，組間差異顯著性檢驗用F 檢驗，兩兩比較用q 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠的組織病理學觀察

正常組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，氣道上皮細胞結(jié)構(gòu)完整無明顯的炎癥細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)形態(tài)未見破壞（第72 頁彩圖圖1①）。 哮喘組：大鼠肺組織可以見到大量炎癥細胞浸潤，黏膜皺襞較多，氣道上皮細胞變性、壞死，可見到管腔狹窄，黏液分泌增多致氣道狹窄、閉塞。肺間質(zhì)可見新生血管形成。大量膠原纖維形成，基底膜加寬加厚，大部分肺泡破壞、融合，肺泡腔擴大，肺泡間隔斷裂（第72 頁彩圖圖1②）。

MAL 電泳圖示：MAL 電泳條帶在185 bp 處可見，正常血清組mRNA 的條帶最亮，柴哮高組、柴哮中組、柴哮低組次之，鹽哮血清、哮喘血清組最暗。結(jié)果見圖2。

圖2 MAL 基因表達電泳圖

2.2 各組MALmRNA 和蛋白表達的比較

MALmRNA 和MAL 的AOD 值在正常血清組最高，與其它各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；柴哮高、中、低組較鹽哮血清組、 哮喘血清組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)果見表1。

表1 各組MAL mRNA 和蛋白表達的比較（±s，n=5）

表1 各組MAL mRNA 和蛋白表達的比較（±s，n=5）

注：與正常血清比較●P＜0.05；與鹽哮血清、哮喘血清比較★P＜0.05。

組 別 MAL mRNA 相對灰度值 OD 值正常血清 0.82±0.04 0.88±0.03鹽哮血清 0.28±0.02● 0.36±0.04●哮喘血清 0.26±0.02● 0.32±0.03●柴哮高組 0.54±0.02●★ 0.57±0.07●★柴哮中組 0.57±0.02●★ 0.62±0.06●★柴哮低組 0.41±0.01●★ 0.49±0.11●★

2.3 各組大鼠氣道上皮細胞中MAL 蛋白的表達

免疫組化結(jié)果顯示：正常血清組、柴哮高組、柴哮中組、柴哮低組、鹽哮血清組、 哮喘血清組均可見MAL 蛋白免疫反應陽性的棕黃色顆粒細胞。 正常血清組表達最強，柴哮高組、柴哮中組、柴哮低組較正常血清組表達減少，在鹽哮血清組、哮喘血清組表達最弱。 見第72 頁彩圖圖3。

3 討論

在哮喘發(fā)病中，氣道上皮細胞可以釋放多種細胞因子和炎癥介質(zhì)，造成級聯(lián)放大效應及上皮細胞的損傷， 導致氣道纖毛的清除功能及屏障功能受損， 長期的慢性炎癥刺激可引起以杯狀細胞增生、上皮細胞纖維化及平滑肌細胞增生肥大為主要病理變化的氣道重塑[5]。Holgate 等[6]認為在有害物質(zhì)刺激下氣道上皮細胞正常修復機制受損，是導致難治性哮喘的重要原因。 可見上皮細胞作為氣道內(nèi)外環(huán)境的第一道物理屏障，其結(jié)構(gòu)的破壞及持續(xù)的炎癥反應，在氣道過敏反應性炎癥及氣道重塑的發(fā)生與發(fā)展中，都有著不可忽略的作用。

MAL 基因最初發(fā)現(xiàn)于1987年，Alons[7]發(fā)現(xiàn)該基因表達于T 淋巴細胞分化中晚期，編碼產(chǎn)物為一種高度疏水性蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，MAL 隸屬于MAL 基因家族，該家族成員編碼產(chǎn)物均屬于四折跨膜蛋白質(zhì)，具有相似的生化特性，并在呼吸系統(tǒng)、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌腺體等多種組織的上皮細胞中均有廣泛表達。

MAL 在氣道上皮細胞內(nèi)表達較顯著，它定位于上皮細胞的頂膜區(qū)，是頂端運輸機制中的膜內(nèi)在蛋白，參與脂質(zhì)囊泡介導的頂端傳送體的形成，將上皮細胞中的蛋白輸送到頂端膜中。 Martín-Belmonte等[8]研究表明，MAL 重要的功能為基底和頂端轉(zhuǎn)運，可在質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體之間循環(huán)運送蛋白，對維持上皮細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性具有重大意義。

MAL 也是上皮細胞的頂端靶向過程中的重要組成部分，與細胞膜上酪氨酸激酶高效率表達有密切聯(lián)系， 研究表明，MAL 參與控制上皮細胞吸收和分泌功能，并可調(diào)控頂端膜蛋白的轉(zhuǎn)運與蛋白的分泌機制[9]。 其功能涉及上皮細胞中胞內(nèi)運輸，信號傳導等相關(guān)方面，與維持上皮細胞正常的形態(tài)和功能密切相關(guān)。 在去除MAL 的情況下，酪氨酸激酶在質(zhì)膜的功能將遭受破壞。 而酪氨酸激酶與多種細胞信號傳導機制有關(guān)，在氣道炎癥反應和氣道重塑中都有十分重要的作用[10]。 MAL 缺失可以引起上皮細胞形態(tài)及功能的改變甚至惡性增殖過程。

中醫(yī)學認為[11]“外因誘發(fā)，觸動伏痰，痰阻氣道，氣道壅塞”為哮喘的發(fā)病機制。 柴樸湯由小柴胡湯和半夏厚樸湯組成，全方有行氣、化痰、平喘的作用。 是中醫(yī)治療哮喘的方劑之一。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柴樸湯可以減輕炎癥細胞的浸潤，抑制氣道的重塑[12]。 通過基因芯片技術(shù)，對差異表達基因進行Pathway 及GO 分析，我們發(fā)現(xiàn)MAL 基因在哮喘大鼠模型中表達下調(diào)， 而柴樸湯可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，且柴樸湯組中氣道炎癥程度及氣道重塑情況都較哮喘模型組減輕，說明柴樸湯治療哮喘的作用靶點可能與MAL 有關(guān)[2]。而MAL基因在氣道上皮細胞中表達較為顯著，與上皮細胞內(nèi)運輸、信號傳導等功能關(guān)系密切，因此我們推測MAL 通過維持氣道上皮細胞的正常形態(tài)和功能，進而抑制哮喘發(fā)生過程中上皮細胞產(chǎn)生細胞因子及炎癥介質(zhì)過程， 從而減弱上皮細胞的炎癥反應，以及炎癥所致的氣道上皮細胞纖維化、氣道重塑的相關(guān)病理變化和發(fā)展。MAL 表達下降則導致氣道上皮細胞正常極性發(fā)生改變，從而使氣道內(nèi)外環(huán)境的第一道物理屏障即氣道上皮發(fā)生了一系列的生理改變，導致哮喘發(fā)生、發(fā)展。

本實驗結(jié)果表明：哮喘血清可誘導氣道上皮細胞中MAL 的表達下調(diào)， 加重氣道上皮的炎癥反應及重塑情況，而柴樸湯上調(diào)MAL 的表達，從而維護氣道上皮的正常結(jié)構(gòu)和功能。 但柴樸湯上調(diào)MAL表達的具體機制，仍有待進一步實驗。

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