益氣活血湯對(duì)急性心肌梗死模型大鼠Ras、ERKl、p-ERKl和C-Raf-1表達(dá)的影響

郭 樂(lè)，潘 坤，尹 勝，楊軍輝*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208）

心肌缺血是由于心臟的血液灌注減少，從而影響心臟的供氧， 缺氧狀態(tài)下心肌能量代謝異常，導(dǎo)致無(wú)法支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。 近年來(lái)一些學(xué)者提出了“治療性血管新生”的新途徑，也就是通過(guò)某些藥物的干預(yù)，增加冠狀動(dòng)脈分支或側(cè)枝循環(huán)，從而達(dá)到恢復(fù)缺血心肌血供，改善患者癥狀和預(yù)后的目的， 但是目前這種設(shè)想僅處在研究階段， 因此通過(guò)治療性血管新生減輕心肌缺血損傷，逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)[1]。 而越來(lái)越多的證據(jù)表明，中藥可從降低心肌耗氧、清除氧自由基、抑制鈣超載、抑制細(xì)胞凋亡、促血管生成等不同途徑起到抗心肌缺血的作用[2]，因此中醫(yī)藥在“治療性血管新生”的新途徑方面表現(xiàn)出了臨床優(yōu)勢(shì)。 我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察益氣活血湯對(duì)大鼠缺血心肌在Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)通路中重要分子的影響， 探討中醫(yī)藥的益氣活血促血管生成作用。 現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康Wister 大鼠64 只，雄性，體質(zhì)量為270～290 g， 由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘2009-0012)，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 藥物與試劑 益氣活血湯處方組成： 黨參20 g，黃芪30 g，丹參20 g。藥物購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)水煎2 次過(guò)濾，合并煎液，濃縮至含生藥2 g/mL，冰箱貯存?zhèn)溆?。倍他?lè)克(metoprolol)，由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為1308102。C-Raf-1 兔源性單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；Ras、p-ERKl 兔源性單克隆抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ERK1 兔源性單克隆抗體由中杉金橋工程有限公司提供。

1.1.3 主要儀器 XD-7100 型動(dòng)物心電圖機(jī)，上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司；KD2258 輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)，金華益迪醫(yī)療設(shè)備公司；BX43 研究型顯微鏡，奧林巴斯集團(tuán)；TP-8 組織攤片機(jī)， 久圣醫(yī)療設(shè)備有限公司；MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有線(xiàn)公司。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 按文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行造模。 大鼠麻醉后固定，氣管插管，連接人工動(dòng)物呼吸機(jī)支持呼吸， 從胸骨左側(cè)第3、4 肋間正中線(xiàn)旁開(kāi)5 mm 行縱向切口， 于心臟左心耳根部下方2～3 mm 處穿線(xiàn)，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，建立心肌缺血模型。 結(jié)扎后迅速將心臟還納，關(guān)閉胸腔，恢復(fù)自主呼吸。 手術(shù)前后連接動(dòng)物心電圖機(jī)，記錄心電圖，以術(shù)后Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST 段弓背向上抬高為造模成功的標(biāo)志。 術(shù)后連續(xù)3 d 注射青霉素80 萬(wàn)U／d 以預(yù)防感染。 假手術(shù)組僅開(kāi)胸穿線(xiàn)，不做其他處理，其余操作同上。

1.2.2 分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為6 組，其中空白對(duì)照組、假手術(shù)組各5 只，模型組、益氣活血湯大劑量組（下稱(chēng)大劑量組）、益氣活血湯小劑量組（下稱(chēng)小劑量組）、倍他樂(lè)克組于造模后隨機(jī)分組，造模54 只，存活32 只，各組8 只。 用藥各組依據(jù)動(dòng)物體質(zhì)量參照動(dòng)物與人體體表面積折算的等效劑量，大劑量組益氣活血湯用藥量為12.6 g/(kg·d)， 小劑量組益氣活血湯用藥量為6.3 g/(kg·d)，加蒸餾水按相同的灌胃體積配制各濃度藥液，每日灌胃1 次；空白對(duì)照組、 模型組與假手術(shù)組大鼠均給予等體積蒸餾水，每日灌胃1 次；倍他樂(lè)克組按10 mg/(kg·d)確定給藥量，每日灌胃1 次。 均造模后24 h 開(kāi)始灌胃，持續(xù)12 d。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 免疫組化方法：以上各組大鼠于灌胃12 d 后隨機(jī)取5 只進(jìn)行腹腔麻醉， 迅速剪開(kāi)胸腹腔，迅速摘取心臟，將缺血區(qū)心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，4%多聚甲醛固定，固定24 h 后組織脫水、透明、浸蠟、包埋，制備厚5 μm 組織切片，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；3%雙氧水滅活，PBS洗3 min，共3 次，抗原修復(fù)，PBS 洗3 min，共3 次，滴加封閉液，室溫（37 ℃）孵育20 min，傾去，勿洗；滴加1∶100 稀釋的一抗，37 ℃孵育2～3 h，PBS 洗3 min， 共3 次， 滴加生物素化二抗工作液， 室溫（37 ℃）孵育20 min，PBS 洗3 min，共3 次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，室溫（37 ℃）孵育20 min，PBS 洗3 min， 共3 次，DAB 顯色， 自來(lái)水洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明中性樹(shù)膠封片。

顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞漿或細(xì)胞核有棕黃色或棕褐色顆粒即為陽(yáng)性表達(dá)，每張切片觀察5個(gè)視野，400倍鏡下觀察照像， 以MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其光密度值，進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 所有計(jì)量資料以“±s”表示，均數(shù)間經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后， 進(jìn)行單因素方差分析， 多重比較采用LSD 和Dunnet 檢驗(yàn)， 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

益氣活血湯對(duì)缺血心肌大鼠Ras、ERK1、p-ERK1 和C-Raf-1 蛋白表達(dá)的影響：

ERK1 蛋白、p-ERK1 蛋白、C-Raf-1 蛋白、Ras蛋白均表現(xiàn)為棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物沉積即為陽(yáng)性著色，ERK1 蛋白主要表達(dá)于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，p-ERK1 蛋白、C-Raf-1 蛋白、RAS 蛋白在心肌細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)。 結(jié)果顯示空白對(duì)照組與假手術(shù)組心肌細(xì)胞染色較淺，呈淡黃色；模型組心肌細(xì)胞內(nèi)呈棕黃色；大、小劑量及倍他樂(lè)克組心肌細(xì)胞染色呈深棕黃色，較模型組顏色深。 見(jiàn)封三彩圖圖1。

各項(xiàng)指標(biāo)空白組與假手術(shù)組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，模型組高于空白組、假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01)。 Ras、C-Raf-1 蛋白表達(dá)：小劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；大劑量組及倍他樂(lè)克組與模型組比較均有增高，且高于小劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；但大劑量組與倍他樂(lè)克組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 ERK1、p-ERK1 蛋白表達(dá)：大、小劑量及倍他樂(lè)克組與模型組比較均有增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01)；大劑量組較小劑量組增多更明顯(P＜0.05)。 倍他樂(lè)克組與大劑量組、小劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義明顯(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 益氣活血湯對(duì)缺血心肌大鼠Ras、ERKl、p-ERK1 和C-Raf-1 蛋白表達(dá)平均光密度值的比較 （±s，n=5）

表1 益氣活血湯對(duì)缺血心肌大鼠Ras、ERKl、p-ERK1 和C-Raf-1 蛋白表達(dá)平均光密度值的比較 （±s，n=5）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與小劑量組相比◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組 別正常組假手術(shù)組模型組小劑量組倍他樂(lè)克組大劑量組C-Raf-1 0.2100±0.0123△△0.2460±0.0182△0.2920±0.0084 0.3020±0.0217 0.3820±0.0192△△◇◇0.4740±0.0573△◇ERK1 0.2840±0.0623△0.3940±0.0230△0.4480±0.0205 0.6160±0.0744△1.2060±0.3074△0.8840±0.1092△△◇p-ERK1 0.2140±0.0365△0.2740±0.0114△0.3160±0.0152 0.3540±0.0152△0.5880±0.1145△0.4100±0.0255△△◇Ras 0.2320±0.0286△0.2660±0.0089△0.3000±0.0123 0.3260±0.0114 0.4000±0.0187△△◇◇0.5120±0.0687△◇光密度值

3 討論

ERK/MAPK 途徑是最重要的細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡等，特別是在血管生成方面作用的研究越來(lái)越清晰。 研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)阻斷ERK/MAPK 此通路，可以在一定程度上抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制宮頸癌的血管的生成[4]，在心肌梗死方面， 可能通過(guò)升高ERK1/2 的活性促進(jìn)心肌梗死后早期的細(xì)胞增殖分化, 并在此后促進(jìn)梗死細(xì)胞的血管再生[5]。

Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)通路是ERK/MAPK 途徑上重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。 Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)通路中，Ras 具有啟動(dòng)因子的作用，活化的Ras 作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與了血管生成的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[6]。 Raf-1 是Ras 的主要靶蛋白， 是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶， 又稱(chēng)MAPKKK，是Ras／Raf／MEK／ERK1/2 信號(hào)通路中的重要因子，其N(xiāo) 端的氨基酸對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有抑制作用，當(dāng)Ras活化后，Raf-1 與Ras 結(jié)合，Raf-1 被催化而激活，活化的Raf 結(jié)合并磷酸化另一種蛋白激酶MEK(MAPKinase Kinase，即MAPKK)，使其活化，MAPKK 又激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，從而完成Ras／Raf／MEK／MAPK 信號(hào)通路整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[7]。 細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)蛋白激酶（ERK）是MARK 族系成員之一，屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，ERK 分為ERKl 和ERK2，統(tǒng)稱(chēng)為ERKl／2，磷酸化ERKl／2 才具有活性，ERKl／2 的活化是將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核的關(guān)鍵。 研究顯示Ras／Raf／MEK／ERK1/2 信號(hào)通路與VEGFR、VEGF 的促血管生成作用關(guān)系密切[8]。

血管新生是一個(gè)多因素、 多機(jī)制的復(fù)雜過(guò)程，而中醫(yī)藥的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特色可為“治療性血管新生”的研究與臨床應(yīng)用有效結(jié)合。益氣活血法是中醫(yī)藥治療心腦血管疾病常用治法，在血管新生方面表現(xiàn)出特殊的研究?jī)r(jià)值。 大量研究也顯示， 益氣活血中藥可調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，啟動(dòng)生長(zhǎng)、增殖信號(hào)，調(diào)節(jié)血管生成，增強(qiáng)機(jī)體抗修復(fù)能力，從而治療血管生成異常的疾病[9-10]。 杜雪君等[11]通過(guò)利用益氣活血中藥人參三七作用于大鼠心肌缺血模型， 顯示人參三七組方可能通過(guò)促進(jìn)Ras的表達(dá)， 從而激活下游的C-Raf-1 及ERKl／2 來(lái)促進(jìn)血管新生， 為我們的研究提供了前期研究依據(jù)。本研究用益氣活血組方，由黨參、黃芪、丹參三味藥組成，方中黨參補(bǔ)氣健脾，黃芪補(bǔ)氣、振奮心氣，丹參活血化瘀，諸藥合用，共奏補(bǔ)益心氣、活血化瘀之功效，通過(guò)研究此方治療心肌缺血的作用，有助于探索益氣活血中藥組方在心肌缺血方面的療效及治療機(jī)制，為中藥于心血管領(lǐng)域的發(fā)展提供了更多微觀實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示， 各因子于造模后均較空白組、假手術(shù)組顯著增加，自身有一定的促血管生成的能力。 對(duì)用藥組的研究發(fā)現(xiàn)，雖然少數(shù)因子表現(xiàn)出小劑量與模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但絕大多數(shù)都表現(xiàn)出了顯著差異，且大劑量均明顯高于小劑量組，而大劑量組與倍他樂(lè)克組之間，各因子均表現(xiàn)為組間差異不顯著。 由此可見(jiàn)使用益氣活血湯后， 提 高 了Ras 通 路 上 重 要 因 子Ras、C-Raf-1、ERKl、p-ERK1 的表達(dá)，且高劑量組均高于低劑量組的表達(dá)，表現(xiàn)出與陽(yáng)性對(duì)照組貝他樂(lè)克相似的優(yōu)勢(shì)及一定的用藥劑量趨勢(shì)，揭示了益氣活血湯可能是通過(guò)調(diào)控Ras 通路上重要因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)缺血后心肌的血管生成，抑制心肌缺血的損傷。

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