參苓白術(shù)散對胃癌IV期患者外周血CD4+CD25+Tregs的影響

周 波，戴飛躍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率高居癌癥死因的第2 位［1］。 然而人們卻不太注重胃癌的早期篩選，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胃癌時患者往往處于臨床IV 期。對于該部分患者，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)公布的胃癌NCCN 指南建議其接受多學(xué)科參與的綜合性治療，而中醫(yī)藥是腫瘤綜合治療不可或缺的部分。 參苓白術(shù)散是治療晚期胃癌脾胃氣虛型患者的有效方劑，它通過健脾益胃增強(qiáng)脾胃功能，提升整體抗癌機(jī)能［2］。但其具體的作用機(jī)制仍未得到闡明。近年來，CD4+CD25+Tregs 介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸機(jī)制在胃癌中得到證實［3］。因此，本研究通過前瞻性臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究， 探明參苓白術(shù)散能否對胃癌IV 期患者外周血CD4+CD25+Tregs 和相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，闡述其療效機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年3月至2013年9月住院治療的40 例經(jīng)胃鏡或手術(shù)病理證實的胃癌患者。 參照2010年國際抗癌聯(lián)盟／美國癌癥聯(lián)合委員會（UICC／AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胃癌TNM 分期，均為臨床IV 期。 隨機(jī)分為2 組。 對照組：男12 例，女8例；年齡42～66 歲，平均（54.0±3.7）歲；分化程度：低分化13 例，中分化7 例；腫瘤部位：賁門及胃底3例，胃體2 例，幽門及胃竇15 例；觀察組：男11 例，女9 例；年齡45～70 歲，平均（57.5±4.0）歲；低分化11 例，中分化9 例；賁門及胃底5 例，胃體3 例，幽門及胃竇12 例。 兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合胃癌IV 期的診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)［4］；符合晚期胃癌脾胃氣虛中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；無嚴(yán)重的心、肝、腎、腦等臟器功能損害；無急慢性肝炎，無免疫系統(tǒng)疾病，近期未使用免疫抑制劑；對本研究內(nèi)容知曉，并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

未按規(guī)定療程服藥者；有嚴(yán)重并發(fā)癥如重癥感染、胃出血、胃穿孔、胃腸梗阻。

1.4 治療方法

對照組予對癥支持治療，主要采用靜脈營養(yǎng)支持治療：靜脈用氮0.15 g/（kg·d），非蛋白質(zhì)熱量為28 kcal/kg，并且補(bǔ)充維生素和微量元素等。 觀察組在對癥支持治療的同時予參苓白術(shù)散， 方藥組成：人參6 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，白扁豆10 g，砂仁10 g， 山藥10 g， 薏苡仁10 g， 桔梗10 g， 蓮子10 g， 甘草3 g。 常規(guī)水煎2 次， 每日2 劑， 每劑200 mL（含生藥0.4 g/mL），溫服，共4 周?；颊咴谥委熎陂g忌食生冷油膩、辛辣之品，禁煙酒，停服其他藥物。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

患者治療前及治療后第4 周晨起空腹抽取上肢靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，共3 管。

1.5.1 外周血CD4+CD25+Tregs 含量 采用FCM方法， 流式細(xì)胞儀檢測，Cellquest 軟件數(shù)據(jù)分析，記錄陽性細(xì)胞百分率。

1.5.2 Foxp3 mRNA 表達(dá)水平 逆轉(zhuǎn)錄-多聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）紫外分光光度計定量總RNA，調(diào)整濃度為：1 μg/μL。 按cDNA 第一鏈反應(yīng)試劑盒說明采用隨機(jī)引物法合成cDNA。用GAPDH 作為內(nèi)行參照行PCR 定量檢測（Foxp3/GAPDH×1000）。Foxp3引物序 列為： 上游：5’-GCTGGTCGG-GA GAAGAGGAAAA -3’， 下 游：5’ -CAGTATCCCACGGAAATAACCT-3’，擴(kuò)增長度：433 bp。GAPDH 引物序列為：上游：5’-AACGGATTTGGTATTG-3’，下游：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，擴(kuò)增長度：208 bp。PCR 參數(shù)：94 ℃5 min 變性；94 ℃35 s，52 ℃40 s，71 ℃55 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖電泳，電壓60 伏，55 min。 Gel ID凝膠分析系統(tǒng)攝片并測定分析其光密度。 計算各個樣本Foxp3 表達(dá)水平。

1.5.3 IL-10、TGF-β1 測定 采用ELISA 雙抗體夾心法，試劑盒由上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供，所有操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 和Foxp3 mRNA 表達(dá)水平的比較

觀察組治療后外周血CD4+CD25+Tregs 含量及Foxp3 mRNA 表達(dá)較治療前均明顯降低， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組治療后各項指標(biāo)無明顯變化（P＞0.05）。 兩組治療后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 兩組治療前后外周血CD4+CD25+Tregs和Foxp3 mRNA 表達(dá)水平的比較（n=20，±s）

表1 兩組治療前后外周血CD4+CD25+Tregs和Foxp3 mRNA 表達(dá)水平的比較（n=20，±s）

注：與本組治療前比較△P＜0.05；與對照組比較*P＜0.05。 下表同。

組 別觀察組對照組治療前治療后治療前治療后CD4+CD25+Tregs（%）28.87±8.45 10.12±4.32△*28.65±8.61 26.99±9.13 Foxp3 mRNA 4.42±0.43 2.18±0.26△*4.48±0.47 4.36±0.42

2.2 兩組治療前后血清IL-10 和TGF-β1 的比較

觀察組治療后血清IL-10 和TGF-β1 濃度較治療前均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組治療后各項指標(biāo)無明顯變化（P＞0.05）。 兩組治療后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組治療前后血清IL-10 和TGF-β1 的比較（±s）

表2 兩組治療前后血清IL-10 和TGF-β1 的比較（±s）

組 別觀察組對照組n 20 20治療前治療后治療前治療后IL-10（pg/L）95.74±7.34 70.56±6.77△*91.77±6.45 88.53±6.78 TGF-β1（ng/mL）18.65±3.52 10.33±3.46△*17.67±3.47 16.42±4.20

3 討論

上世紀(jì)初，Ehrlich 等提出了腫瘤免疫的概念，隨后Thomas 和Burnet 等又進(jìn)一步提出了腫瘤的免疫監(jiān)視理論。 隨著腫瘤免疫研究的深入，學(xué)者們逐漸發(fā)現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的平衡在機(jī)體的抗腫瘤免疫作用中發(fā)揮著重要作用。 CD4+CD25+Tregs 是一類具有免疫抑制功能的T 淋巴細(xì)胞亞群，它可以通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β 發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)抑制腫瘤特異性T 淋巴細(xì)胞， 減少T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，使其逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。 研究表明，胃癌患者外周血中腫瘤特異性CD4+CD25+Tregs 增多， 通過抑制CD4+Th1 和CD8+T 淋巴細(xì)胞誘發(fā)腫瘤發(fā)生免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］。 近年來，CD4+CD25+Tregs 是腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。 本研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散干預(yù)胃癌IV 期患者后外周血CD4+CD25+Tregs 和相應(yīng)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1 均下降， 這可改善胃癌患者體內(nèi)腫瘤特異性T 淋巴細(xì)胞的抑制狀態(tài)， 因此，參苓白術(shù)散具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。

1995年，Sakaguchi 等率先在小鼠外周血中分離獲得發(fā)揮免疫抑制功能的CD4+CD25+Tregs，該群細(xì)胞持續(xù)表達(dá)CD25（IL-2 受體α 鏈），被稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 隨后，F(xiàn)ontenot 等研究小組同時報道X 染色體編碼的Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/ winged helix transcription factor，叉狀頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子)特異性表達(dá)于CD4+CD25+Tregs，是Tregs 發(fā)育、活化、發(fā)揮功能的關(guān)鍵，可作為特異標(biāo)志。Foxp3 是目前公認(rèn)的特異性最強(qiáng)的Tregs 分子標(biāo)志物［7］。Kryczek I 的研究表明Foxp3 是腫瘤患者和免疫缺陷性疾病患者體內(nèi)的Tregs 特異性分子標(biāo)志物［8］。在國內(nèi)有研究表明胃癌組織中Foxp3+Tregs 的浸潤是胃癌術(shù)后的獨(dú)立危險因素，F(xiàn)oxp3+Tregs 高表達(dá)者預(yù)后很差［9］。 中藥復(fù)方參苓白術(shù)散具有多種藥理效應(yīng)的物質(zhì)成分，能對腫瘤特異性CD4+CD25+Tregs 起到干預(yù)作用。 本研究發(fā)現(xiàn)， 參苓白術(shù)散干預(yù)胃癌IV 期患者后外周血單個核細(xì)胞Foxp3 mRNA 減少，這很可能是其降低外周血CD4+CD25+Tregs 的原因。

中醫(yī)學(xué)家臨床發(fā)現(xiàn)晚期胃癌患者往往表現(xiàn)為正虛邪實的病理狀態(tài)，以正虛為本，依據(jù)精氣奪則虛，治法往往偏“補(bǔ)”。 臨床上胃癌IV 期患者通過整體觀和辨證施治運(yùn)用參苓白術(shù)散治療后中醫(yī)證候、體力狀態(tài)、生活質(zhì)量及近期生存均有效改善，但是其治療的科學(xué)內(nèi)涵仍未得到闡述。 目前，腫瘤免疫逃逸機(jī)制和腫瘤的免疫治療一直是腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的重點(diǎn)。 很多中藥和中藥復(fù)方（補(bǔ)益作用）的有效組分對機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。 本研究顯示，健脾益氣之參苓白術(shù)散能對胃癌患者腫瘤特異性CD4+CD25+Tregs 和其分泌的抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1 起到抑制作用， 并能降低CD4+CD25+Tregs 的特征性標(biāo)志Foxp3 的表達(dá)。 缺少核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，外周血CD4+CD25+Tregs 減少。 本研究初步闡明了參苓白術(shù)散扶正抗癌的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，但未探討其量效關(guān)系、時效關(guān)系以及影響Foxp3表達(dá)的上游機(jī)制仍未清晰，有待進(jìn)一步研究。

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