馬錢子堿透皮貼劑鎮(zhèn)痛實驗研究及對大鼠腦啡肽含量的影響

崔 姣，許惠琴*，陶玉菡

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210046）

馬錢子為馬錢科植物馬錢子(Strychnos nuxvomica L.)的干燥成熟種子，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功效。 近年來， 馬錢子廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的臨床治療， 具有較好的抗癌和癌性疼痛的作用， 成為抗腫瘤中藥研究的一個熱點。 馬錢子主要活性成分是吲哚類生物堿， 士的寧和馬錢子堿是最主要的兩種生物堿， 二者含量占馬錢子總生物堿的70%～80%，其中馬錢子堿是馬錢子鎮(zhèn)痛的主要活性成分[1]。 但是馬錢子毒性較大，其治療劑量和中毒劑量接近。

本實驗室前期試驗已經(jīng)表明馬錢子堿經(jīng)皮給藥后的絕對生物利用度為32.8%， 平均滯留時間（MRT）是靜脈注射的8 倍，經(jīng)皮給藥途徑可能有利于馬錢子堿的減毒增效[2]，且初步進行了小鼠醋酸扭體實驗的研究[3]。 本試驗在此基礎(chǔ)上研究馬錢子堿透皮吸收后的鎮(zhèn)痛作用及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 CL 級ICR 小鼠50 只， 許可證號：SCXK （蘇）2008-0010；SD 大鼠100 只， 許可證號：SCXK(蘇)2007-0001，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

1.1.2 主要藥物 馬錢子堿，日本和光純藥工業(yè)株式會社，批號：059-17；芬太尼透皮貼劑（西安楊森制藥有限公司）。

1.1.3 主要試劑 冰醋酸： 上海化學(xué)試劑有限公司，批號：03081014。 5-HT，由Sigma 公司提供，批號：29H7011。磷酸鹽緩沖液(PBS)：中杉金橋。氯化鈉注射液，山東華魯制藥有限公司，批號：B08110807。氫氧化鈉(NaOH)， 天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司，批號：20090420。

1.1.4 主要儀器 UniCel DxI800（BECKMAN COULTER）；5415R 低溫高速離心機 （基因有限公司）；YLS-9A 生理藥理電子刺激儀 （淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；YLS 壓痛儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；TB-04 型實驗用精密涂布機（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 馬錢子堿透皮貼劑的制備 首先采用冷凍干燥法制備馬錢子堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，再在骨架材料溶液中加入馬錢子堿包合物，采用精密涂布機涂布在背襯膜上，切割成型。1 cm2透皮貼劑含24 mg 馬錢子堿， 分別切割成大約0.05、0.1、0.2 cm2用于小鼠藥效學(xué)實驗， 切割成大約0.25、0.5、1 cm2用于大鼠藥效學(xué)實驗。

1.2.2 測定馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響 取健康ICR 小鼠50 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，隨機均分為5 組：（1）空白對照組（下稱A 組）：空白基質(zhì)；（2）芬太尼組（下稱B 組）：40 mg/kg；（3）馬錢子堿透皮貼劑小劑量組（下稱C組）：60 mg/kg；（4）馬錢子堿透皮貼劑中劑量組（下稱D 組）：120 mg/kg；（5）馬錢子堿透皮貼劑大劑量組（下稱E 組）：240 mg/kg。 各組小鼠腹部剃毛器剃毛后，給予藥物，用膠帶固定。 每只小鼠給藥1 次。

實驗用生理實驗多用儀進行，給藥前將小鼠放在導(dǎo)電銅絲板上，通電后，調(diào)節(jié)電壓輸出鈕，使電壓由低到高，以秒表記錄時間，當(dāng)小鼠出現(xiàn)第一聲尖叫時立即斷電， 此段時間為小鼠用藥前的痛閾值，固定此電壓值不變，給藥后在不同時間點（20 min及1、2、4、8、10 h） 以同等電壓強度進行自身對照，刺激時間1 s，頻率為8 Hz，電壓保持不變。 用藥前痛閾值低于15 s 者剔除不用， 用藥后痛閾值超過45 s 即可切斷刺激，痛閾以45 s 計。

1.2.3 測定馬錢子堿透皮貼劑對大鼠5-HT 致痛作用的影響 取健康SD 大鼠50 只， 雄性， 體質(zhì)量180～200 g， 隨機均分為5 組：（1）A 組： 空白基質(zhì)；（2）B 組： 20 mg/kg；（3）C 組：30 mg/kg；（4）D 組：60 mg/kg；（5）E 組：120 mg/kg。 各組大鼠腹部剃毛，給予藥物后，用膠帶固定。 每只大鼠給藥1 次。

各組給藥前用壓足法測定大鼠右后足基礎(chǔ)痛閾值(取3 次平均值，法碼值小于50 g 或大于750 g棄之不用)。給藥30 min 后，每只大鼠右后肢足跖皮下注射1%～2% 5-HT 0.1 mL 致炎，測量大鼠給藥后1、2、4、8 h 致炎足的痛閾。

鎮(zhèn)痛率=[(給藥后痛閾值-給藥前痛閾值)／給藥前痛閾值]×100%

1.2.4 測定馬錢子堿透皮貼劑對大鼠大腦功能區(qū)腦啡肽含量的影響 取健康SD 大鼠50 只，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，分組及給藥方法同“1.2.3”。每只大鼠給藥1 次。

大鼠禁食過夜，次晨給藥后30 min，在安靜狀態(tài)下快速斷頭取腦，置煮沸生理鹽水中3 min。取出后依照圖譜取腦干、下丘腦、丘腦與紋狀體。 各腦區(qū)分別稱質(zhì)量后置3 mL 的1.0 mol/L 鹽酸勻漿器中制成勻漿， 再加0.3 mL 的1.0 mol/L NaOH 及0.7 mL 的0.5 mol/L pH 7.6 的磷酸緩沖液，最后加PBS 液，補足至5 mL 后離心20 min，取上清液在放免測定儀上作放射免疫分析（RIA）測定，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線將實驗結(jié)果換算成每克腦組織中的腦啡肽含量(pg)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0 軟件進行處理。 實驗數(shù)據(jù)用“±s”表示，組間差異顯著性判斷采用方差分析，組間比較采用LSD 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響

實驗結(jié)果顯示：馬錢子堿透皮貼劑3個劑量組在4、8、10 h 3個時間點能提高小鼠痛閾值百分率，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。 見表1。

2.2 馬錢子堿透皮貼劑對5-HT 致炎后大鼠足壓痛的影響

實驗結(jié)果顯示：E 組在1、2、4、8 h 4個時間點能提高致炎大鼠足壓痛的痛閾值百分率，與A 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；D 組在2、4、8 h 3個時間點能提高致炎大鼠足壓痛的痛閾值百分率， 與A 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01，P＜0.05）。 C 組在2、4 h 2個時間點能提高致炎大鼠足壓痛的痛閾值百分率，與A 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表2。

表1 馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響 （±s，n=10，s）

表1 馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響 （±s，n=10，s）

注：與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01。 下表同。

組別A 組B 組C 組D 組E 組劑量（mg/kg）—40 60 120 240 20 min 11.6±7.4 12.9±12.3 11.2±4.5 13.1±6.1 16.5±14.3 1 h 12.4±8.7 24.6±17.2 14.9±6.4 13.8±5.3 24.1±16.0 2 h 12.7±10.5 27.7±17.2*23.5±11.2 21.5±8.9 26.6±16.8 4 h 10.6±8.8 29.1±16.9*25.1±14.0*30.4±11.9**37.8±13.9**8 h 13.3±8.9 33.8±14.3**27.7±14.4*31.4±12.5**33.5±16.3**10 h 18.2±8.9 33.1±16.2*29.9±11.3*29.8±13.9*36.9±13.4**測量時間點

表2 馬錢子堿透皮貼劑對5-HT 致炎后大鼠足壓痛的影響（鎮(zhèn)痛率） （±s，n=10，%）

表2 馬錢子堿透皮貼劑對5-HT 致炎后大鼠足壓痛的影響（鎮(zhèn)痛率） （±s，n=10，%）

組 別A 組B 組C 組D 組E 組劑量（mg/kg）—20 30 60 120 1 h 15.7±68 46.3±39 66.6±63 185.2±156 172.4±135*2 h 21.1±51 87.7±81*181.0±137**200.0±181**271.7±190**4 h 32.9±51 178.5±109**170.1±117**200.2±191**236.8±175**8 h 24.1±59 97.5±95*86.5±63 146.2±127*135.6±110*測量時間點

2.3 馬錢子堿透皮貼劑對大鼠功能區(qū)腦啡肽含量的影響

實驗結(jié)果顯示：D 組、E 組能提高大鼠大腦功能區(qū)腦啡肽的含量，與A 組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

表3 馬錢子堿透皮貼劑對各組大鼠功能區(qū)腦啡肽含量的影響 （±s，n=10）

表3 馬錢子堿透皮貼劑對各組大鼠功能區(qū)腦啡肽含量的影響 （±s，n=10）

組別A 組B 組C 組D 組E 組劑量（mg/kg）—20 30 60 120腦啡肽含量（pg/g）9.85±3.27 12.27±3.04 12.62±4.47 15.37±3.57**16.49±1.99**

3 討論

經(jīng)皮途徑給藥可能是避免馬錢子堿毒性反應(yīng)的有效手段。 馬錢子堿同時具有中樞和外周鎮(zhèn)痛作用[1]，經(jīng)皮給藥途徑降低中樞神經(jīng)毒性的同時可能降低了其中樞鎮(zhèn)痛作用，但對外周鎮(zhèn)痛作用（如麻痹神經(jīng)末梢）影響可能不大。 前期實驗通過小鼠醋酸扭體法表明馬錢子堿貼劑透皮吸收完全，能對抗醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)[3]。 本實驗結(jié)果表明馬錢子堿透皮貼劑能提高小鼠電刺激致痛的痛閾值和5-HT 致炎大鼠的鎮(zhèn)痛率。 與芬太尼組比較，馬錢子堿組能發(fā)揮與其等同的藥效。

腦啡肽是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的一種多肽激素，屬內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)。 內(nèi)源性阿片肽是體內(nèi)具有阿片樣活性的一類物質(zhì)，通過作用于不同部位的各種類型的阿片受體，發(fā)揮復(fù)雜而又多樣的生理調(diào)節(jié)作用。 大腦功能區(qū)的腦啡肽是腦內(nèi)含量最高的內(nèi)源性神經(jīng)肽，具有廣泛的鎮(zhèn)痛作用[4]。 芬太尼為阿片受體激動劑，屬強效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，治療中度到重度慢性疼痛以及那些只能依靠阿片樣鎮(zhèn)痛藥治療的難消除的疼痛， 但是芬太尼血清的濃度逐漸增加，在12～24 h 內(nèi)達到穩(wěn)定，故在給藥30 min 后對腦啡肽的影響不大。 馬錢子中、大劑量組能提高大鼠大腦功能區(qū)腦啡肽的含量，提示馬錢子堿的中樞鎮(zhèn)痛作用可能是通過增加腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)--腦啡肽發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，并且血清的濃度增加較快。

綜上， 馬錢子堿透皮貼劑具有較好的鎮(zhèn)痛作用，吸收比較快，作用時間比較長，減少給藥的頻率，避免了藥物濃度的波動，能起到平穩(wěn)鎮(zhèn)痛，極大程度上避免了馬錢子的毒性作用。 此外，馬錢子堿透皮貼劑鎮(zhèn)痛作用可能是通過增加大腦功能區(qū)腦啡肽的含量，作用于阿片受體，起到中樞鎮(zhèn)痛的作用。

[1]Yin W，Wang TS，Yin F Z，et al. Analgesic and anti-inflammatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnosnux-vomica [J]. J Ethnopharmacol，2003，88(2-3)：205-214.

[2]陳 軍，王立杰，蔡寶昌，等.馬錢子堿經(jīng)皮給藥后在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究[J].中草藥，2010，41(8)：1 350-1 352.

[3]胡 巍，陳 軍，蔡寶昌，等.馬錢子堿經(jīng)皮給藥的鎮(zhèn)痛作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(2)：385-386.

[4]Braz J，Beaufour C，Coutaux A，et al. Therapeutic efficacy in experimental polyarthritis of viral-driven enkephalin overproduction in sensory neurons [J]. J Neurosci，2001，21(20)：7 881-7 888.